형광 현미경 검사를 위한 곤충 다리 처리: 이미징을 위한 신경근 구조를 보존하는 방법

- 시작하려면 마취 된 곤충을 70 % 에탄올 용액에 담궈 큐티클의 소수성을 줄입니다. 그런 다음 세제가 함유된 인산염 완충 식염수로 조직을 최소 30분 동안 세척하고 투과시켜 고정 중에 조직이 침투할 수 있도록 합니다.

다음으로 흉부에서 머리와 복부를 제거합니다. 집게를 사용하여 콕사-흉부 접합부에 부드러운 압력을 가하고 다리를 분리합니다. 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드 용액에 다리를 조심스럽게 넣어 하룻밤 동안 조직에 침투할 수 있도록 합니다. 파라포름알데히드는 단백질을 가교하여 조직을 고정합니다.

그런 다음 고정 용액을 제거하고 인산염 완충 식염수 함유 세제로 조직을 여러 번 씻습니다. 장착하기 전에 다리를 순수하거나 약간 희석된 장착 버퍼에 최소 하루 동안 넣어 버퍼가 조직에 들어갈 수 있는 충분한 시간을 제공합니다.

마지막으로 장착 매체 한 방울에 다리를 장착합니다. 현미경 슬라이드와 커버슬립 사이에 스페이서를 사용하여 표본이 손상되지 않도록 하고 매니큐어로 마운트를 고정합니다.

다음 예에서는 Drosophila melanogaster 다리의 해부, 고정 및 장착을 볼 수 있습니다.

- 유리 멀티웰 플레이트에 70% 에탄올로 적절한 수의 웰을 채우는 것으로 시작합니다. 브러시를 사용하여 연령 또는 성별에 관계없이 15-20마리의 이산화탄소 마취 파리를 각 웰에 추가하고 파리가 완전히 잠길 때까지 에탄올에 부드럽게 두드립니다.

1분 이상 걸리지 않은 후, 인산염 완충 식염수에 0.3% 비이온성 계면활성제 세제 용액으로 파리를 세척당 최소 10분 동안 세 번 헹굽니다. 마지막 세척 후 집게를 사용하여 흉부나 다리를 손상시키지 않고 각 파리의 머리와 복부를 제거하고 한 쌍의 가는 집게의 끝을 사용하여 콕사-흉부 접합부에 부드럽지만 단단히 압력을 가하여 흉부에서 한쪽 다리를 분리합니다.

얼음 위에 갓 준비한 4% 파라포름알데히드가 들어 있는 새로운 멀티웰 플레이트의 한 웰에 다리를 놓고 섭씨 4도에서 하룻밤 배양합니다.

- 다리가 잘 고정되기 위해서는 다리가 뜨지 않도록 다리를 고정 완충액에 부드럽게 밀어 넣는 것이 중요합니다.

- 다음날, 신선한 0.3% 비이온성 계면활성제 세제 용액에 다리를 세탁할 때마다 20분 동안 다리를 5회 세탁합니다. 마지막 세탁 후 세제를 장착 매체로 교체하고 다리를 장착 매체에 최소 24시간 동안 보관하십시오.

다음 날, 유리 현미경 슬라이드의 코팅된 끝 부분 옆에 약 20마이크로리터의 70% 글리세롤을 추가하고 글리세롤을 22 x 22mm 커버슬립으로 덮습니다. 다음으로, 커버슬립 오른쪽에 약 10마이크로리터 라인의 장착 매체를 추가하고 10마이크로리터 라인의 오른쪽에 두 번째 30마이크로리터 장착 매체 라인을 적용합니다.

가는 집게를 사용하여 매체 방울에 있는 멀티웰 플레이트에서 10마이크로리터 장착 매체 스트립으로 한쪽 다리를 바깥쪽 위 또는 아래 방향으로 옮깁니다. 6-8개의 다리가 장착되고 정렬될 때까지 반복하고 두 번째 덮개 슬립이 첫 번째 덮개 슬립에 약간 놓이도록 다리 위에 두 번째 덮개 슬립을 놓습니다. 그런 다음 커버슬립의 각 모서리에 매니큐어를 사용하여 제자리에 고정합니다.