면역염색을 위한 고정 초파리 난모세포의 준비: 외막을 고정하고 제거하는 고처리량 방법

- 마취된 초파리와 믹서기에 완충액을 넣고 펄스를 내어 파리를 작은 조각으로 분해하는 것으로 시작합니다. 메쉬를 통해 혼합물을 필터링하여 큰 신체 부위를 제거합니다. 그런 다음 더 큰 조각이 표면에 남아 제거할 수 있는 동안 알이 가라앉도록 합니다.

더 작은 메쉬를 사용하여 이 프로세스를 반복하여 추가 파편을 제거합니다. 유리병에 난자를 모으고, 난자를 약물로 처리해야 하는 경우 이 시점에서 처리하십시오. 그런 다음 액체를 제거하고 고정제로 교체하십시오. 헵탄을 첨가하여 고정액이 난자를 둘러싼 막을 관통할 수 있도록 합니다.

그런 다음 PBS로 정착제를 씻어냅니다. 난모세포를 염색하려면 항체가 침투할 수 있도록 보호 외막을 제거합니다. 난모세포를 유리 슬라이드의 젖빛 부분에 피펫으로 넣습니다. 알 위에 커버슬립을 놓고 커버슬립을 앞뒤로 부드럽게 굴려 난자에서 융모막과 유리막을 기계적으로 분리합니다. 이제 난모세포를 염색할 준비가 되었습니다.

예시 프로토콜에서는 방추체 장치를 염색하고 시각화하기 위해 감수분열 I에서 난모세포를 준비할 것입니다.

- 먼저 난모세포가 표면에 달라붙는 것을 방지하기 위해 5ml 튜브와 파스퇴르 피펫 내부를 PTB로 미리 절단합니다. 100ml의 Rob's buffer를 블렌더에 넣은 다음 마취된 파리 100-300마리를 넣고 1초 동안 세 번 펄스를 누릅니다.

생성된 슬러리를 약 1500마이크로미터의 기공이 있는 큰 메쉬를 통해 250ml 비커로 필터링합니다. 여과액이 약 2분 동안 가라앉도록 한 다음 최상층을 흡인하여 가능한 한 많은 큰 신체 부위를 제거합니다. 기공 크기가 300마이크로미터인 더 작은 메쉬를 통해 250ml 비커로 슬러리를 다시 필터링합니다.

코팅된 피펫의 추가 버퍼를 사용하여 첫 번째 비커를 헹구어 나머지 난모세포를 수집합니다. 슬러리를 3분 동안 가라앉힌 다음 아래쪽 10ml를 제외한 모든 것을 흡입합니다. 코팅된 5밀리리터 튜브에 10밀리리터를 최대한 붓습니다. 슬러리를 약 2분 동안 가라앉힌 다음 액체를 조심스럽게 제거합니다.

나머지 10ml의 슬러리를 넣고 액체를 제거하기 전에 혼합물을 다시 가라앉히십시오. 코팅된 피펫의 추가 버퍼를 사용하여 비커에서 남아 있는 난모세포를 헹굽니다. 헹굼을 5ml 튜브에 3-5분 동안 담그십시오.

난소를 고정하려면 먼저 조직에서 모든 액체를 흡인하고 즉시 1ml의 고정 혼합물을 추가합니다. 티슈를 너트 에이터에 2분 30초 동안 놓습니다. 다음으로, 헵탄 1ml를 넣고 1분 동안 튜브를 소용돌이친 다음 난모세포가 1분 더 가라앉도록 합니다.

침전된 조직에서 모든 액체를 제거한 다음 1x PBS 1ml를 추가합니다. 30초 동안 튜브를 소용돌이치게 한 다음 난모세포가 1분 동안 가라앉도록 합니다. 그런 다음 튜브에서 모든 액체를 제거하고 1x PBS 5ml로 채웁니다.

코팅된 피펫을 사용하여 약 500-1,000개의 난모세포를 젖빛 유리 슬라이드에 추가합니다. 집게를 사용하여 불필요한 신체 부위나 물질을 제거합니다. 조직 위에 커버슬립을 놓고 모든 막이 제거될 때까지 난모세포를 부드럽게 굴립니다. 커버슬립의 가장자리를 난모세포를 가로질러 드래그하면 잘 작동합니다. 주기적으로 현미경으로 멤브레인 제거 진행 상황을 확인하십시오. 너무 많은 압력은 난모세포를 파괴합니다.