Chorion and Vitelline membrane mechanical removal: 직접 관찰을 위해 초파리 난모세포를 준비하는 방법

- 식염수에 있는 고정된 난소에서 채취한 성숙한 난모세포로 시작합니다. 성숙한 난모세포는 외부 융모막과 내부 유리막으로 구성된 난자를 가지고 있습니다.

융모막과 유리막을 기계적으로 제거하려면 전처리된 두 슬라이드의 서리로 덥은 부분 사이에 난모세포를 배치합니다. 상단 슬라이드를 앞뒤로 똑바로 움직여 난모세포를 굴리는 마찰을 만듭니다.

이제 상단 슬라이드를 약간 비스듬히 움직여 난모세포를 다른 방향으로 굴립니다. 원형 운동을 피하고 상단 슬라이드가 하단 슬라이드에 수직으로 이동할 때까지 이 각도를 짧게 늘립니다. 이 움직임은 맥락막과 유리막을 기계적으로 제거하여 프로브나 염색체가 난모세포에 접근할 수 있도록 합니다.

융모막이 없는 난모세포는 길고 가늘게 보이며, 유리막이 없는 난모세포는 끝이 뾰족합니다. 제거된 난모세포를 주변 파편에서 분리하려면 샘플 혼합물을 튜브로 옮기고 난모세포가 바닥에 가라앉고 파편은 상단에 떠 있어 제거할 수 있도록 합니다.

이 프로토콜에서는 성숙한 초파리 난모세포에서 융모막과 유리막을 제거합니다.

- 후기 단계의 난모세포를 분리하려면 먼저 얕은 해부 접시에 PBSBTx 1ml를 추가합니다. 그런 다음 BSA 코팅된 팁이 있는 P200을 사용하여 고정된 난소를 얕은 접시로 옮깁니다. BSA로 코팅된 피펫 팁으로 난소를 위아래로 피펫팅하여 덜 성숙한 난모세포에서 성숙한 난모세포를 제거합니다.

후기 단계의 난모세포가 충분히 분리되면 모든 조직을 500마이크로리터 마이크로분리관으로 옮깁니다. 파스퇴르 피펫을 당겨 과도한 액체를 제거하고 튜브에 약 150-200 마이크로 리터를 남겨 둡니다.

난모 세포 롤링을 준비하려면 200마이크로리터의 PBSBTx로 깊은 웰 접시를 미리 적십니다. 접시를 덮고 따로 보관하십시오.

젖빛 유리 슬라이드 3개를 얻고 슬라이드 3개를 옆에 둡니다. 다음으로, 슬라이드 1과 2의 젖빛 유리 부분을 함께 부드럽게 문지릅니다. 탈이온수로 헹구어 유리 파편을 제거하고 일회용 물티슈로 말리십시오. 한 슬라이드에 50마이크로리터의 PBSBTx를 추가하고 이 영역을 다른 슬라이드로 문질러 슬라이드 1과 2의 젖빛 영역을 PBSBTx로 코팅합니다. 일회용 물티슈로 액체를 제거하고 슬라이드를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 슬라이드 1과 2의 서리로 덥은 부분이 슬라이드 2를 지지하는 슬라이드 3과 접촉하도록 합니다.

난모세포를 굴리려면 먼저 P200 피펫 팁을 PBSBTx에 미리