Chorion and Vitelline membrane mechanical removal: 직접 관찰을 위해 초파리 난모세포를 준비하는 방법

- 식염수에 있는 고정된 난소에서 채취한 성숙한 난모세포로 시작합니다. 성숙한 난모세포는 외부 융모막과 내부 유리막으로 구성된 난자를 가지고 있습니다.

융모막과 유리막을 기계적으로 제거하려면 전처리된 두 슬라이드의 서리로 덥은 부분 사이에 난모세포를 배치합니다. 상단 슬라이드를 앞뒤로 똑바로 움직여 난모세포를 굴리는 마찰을 만듭니다.

이제 상단 슬라이드를 약간 비스듬히 움직여 난모세포를 다른 방향으로 굴립니다. 원형 운동을 피하고 상단 슬라이드가 하단 슬라이드에 수직으로 이동할 때까지 이 각도를 짧게 늘립니다. 이 움직임은 맥락막과 유리막을 기계적으로 제거하여 프로브나 염색체가 난모세포에 접근할 수 있도록 합니다.

융모막이 없는 난모세포는 길고 가늘게 보이며, 유리막이 없는 난모세포는 끝이 뾰족합니다. 제거된 난모세포를 주변 파편에서 분리하려면 샘플 혼합물을 튜브로 옮기고 난모세포가 바닥에 가라앉고 파편은 상단에 떠 있어 제거할 수 있도록 합니다.

이 프로토콜에서는 성숙한 초파리 난모세포에서 융모막과 유리막을 제거합니다.

- 후기 단계의 난모세포를 분리하려면 먼저 얕은 해부 접시에 PBSBTx 1ml를 추가합니다. 그런 다음 BSA 코팅된 팁이 있는 P200을 사용하여 고정된 난소를 얕은 접시로 옮깁니다. BSA로 코팅된 피펫 팁으로 난소를 위아래로 피펫팅하여 덜 성숙한 난모세포에서 성숙한 난모세포를 제거합니다.

후기 단계의 난모세포가 충분히 분리되면 모든 조직을 500마이크로리터 마이크로분리관으로 옮깁니다. 파스퇴르 피펫을 당겨 과도한 액체를 제거하고 튜브에 약 150-200 마이크로 리터를 남겨 둡니다.

난모 세포 롤링을 준비하려면 200마이크로리터의 PBSBTx로 깊은 웰 접시를 미리 적십니다. 접시를 덮고 따로 보관하십시오.

젖빛 유리 슬라이드 3개를 얻고 슬라이드 3개를 옆에 둡니다. 다음으로, 슬라이드 1과 2의 젖빛 유리 부분을 함께 부드럽게 문지릅니다. 탈이온수로 헹구어 유리 파편을 제거하고 일회용 물티슈로 말리십시오. 한 슬라이드에 50마이크로리터의 PBSBTx를 추가하고 이 영역을 다른 슬라이드로 문질러 슬라이드 1과 2의 젖빛 영역을 PBSBTx로 코팅합니다. 일회용 물티슈로 액체를 제거하고 슬라이드를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 슬라이드 1과 2의 서리로 덥은 부분이 슬라이드 2를 지지하는 슬라이드 3과 접촉하도록 합니다.

난모세포를 굴리려면 먼저 P200 피펫 팁을 PBSBTx에 미리 적시고 위아래로 피펫팅하여 마이크로분리 튜브의 난모세포를 분산시킵니다. 난모세포를 포함하는 50마이크로리터의 액체를 슬라이드 1의 젖빛 유리 부분 중앙으로 옮깁니다. 이렇게 하려면 슬라이드 2를 들어 올립니다.

액체의 표면 장력이 두 개의 젖빛 유리 영역 사이에 밀봉을 만들 때까지 슬라이드 2를 천천히 내립니다. 서리가 내린 부분을 덮을 수 있을 만큼 충분한 액체가 있어야 하지만 아무 것도 새어 나오지 않아야 합니다. 그런 다음 한 손으로 하단 슬라이드 1을 제자리에 잡고 다른 손을 사용하여 상단 슬라이드 2를 수평 방향으로 앞뒤로 움직여 슬라이드 2를 수평으로 유지하고 슬라이드 3을 지지합니다.

난모세포의 움직임과 진행 상황을 쉽게 시각화할 수 있도록 현미경 아래에서 수행합니다. 수평 방향으로 몇 번 움직인 후 이동 각도를 약간 변경합니다. 여러 증분으로 상단 슬라이드 2의 이동이 시작 방향에 수직이 될 때까지 이 각도를 90도까지 점차적으로 증가시킵니다. 빈 맥락막은 액체에서 볼 수 있으며 맥락막이 없는 난모세포는 더 길고 얇게 보입니다.

- 난모세포를 굴릴 때 롤링 방향이 항상 직선이고 원을 그리지 않도록 하십시오.

- 용액이 약간 흐려질 때까지 약 7-10회 롤링을 반복합니다. 대부분의 난모세포가 유리막을 잃은 것처럼 보이면 굴러가는 것을 멈춥니다.

상단 슬라이드 2를 부드럽게 들어 올려 모서리 중 하나를 하단 슬라이드 1의 서리 영역 중앙으로 드래그하여 롤링된 난모세포가 서리 영역의 중앙에 축적되도록 합니다. PBSBTx가 포함된 두 슬라이드의 난모세포를 PBSBTx가 들어 있는 깊은 우물 접시에 헹굽니다.

슬라이드 1과 2를 초순수로 청소합니다. 일회용 물티슈로 말리고 재설정하십시오. 동일한 유전자형의 모든 난모세포가 굴러갈 때까지 이 단계를 반복합니다. 이것은 일반적으로 유전자형당 3-4번의 롤링이 필요합니다.

압연 후 이물질을 제거하려면 15ml 원추형 튜브에 1ml PBSBTx를 추가합니다. 액체를 휘젓어 튜브의 측면을 코팅합니다. PBSBTx로 코팅된 P1000 피펫 팁을 사용하여 딥웰 접시에서 압연된 난모세포를 1ml의 PBSBTx가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다.난모세포가 들어 있는 원뿔형 튜브에 2ml의 PBSBTx를 추가합니다.

어두운 배경에 원뿔형 튜브를 대고 가라앉는 불투명한 난모세포를 확인합니다. 난모세포가 바닥에 가라앉도록 한 후 P1000을 사용하여 파편이 포함된 상단 2ml의 용액을 제거하고 버립니다.

총 3차례의 잔해 제거 단계를 반복한 후 PBSBTx로 코팅된 P1000 피펫 팁을 사용하여 난모세포를 원래의 500마이크로리터 마이크로분리 튜브로 다시 옮깁니다.20-25명의 암컷은 약 50마이크로리터의 성숙한 난모세포를 생성해야 합니다.