초파리 In Vivo 칼슘 이미징: 뉴런 활동의 기능적 이미징 방법

- 초파리 신경계에서 생체 내 칼슘 이미징을 수행하려면 GCaMP와 같은 유전적으로 암호화된 칼슘 지표의 발현을 관심 뉴런에 표적으로 합니다. 뉴런이 활동 전위를 발사할 때, 막의 급격한 탈분극은 전위의존성 칼슘 채널을 열어 세포 외 칼슘이 세포로 유입되도록 합니다.

GCaMP는 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)이 변형되어 N-말단에 있는 미오신 경쇄의 M13 단편과 C-말단에 있는 칼슘 결합 단백질인 칼모듈린(calmodulin)에 융합된 융합 단백질입니다. 칼슘은 칼모듈린에 결합하여 GCaMP의 형태 변화를 유발하여 단백질의 형광을 증가시킵니다.

생체 내 신경 활동에 대한 대용물로서 GCaMP 형광의 변화를 이미지화하려면 예상되는 활동으로 신경계 영역을 노출시킵니다. 그런 다음 GCaMP 역학을 캡처할 수 있고 자극 전달 설정이 장착된 형광 현미경을 사용합니다. 예를 들어 냄새와 같은 자극을 전달하면서 반응하는 뉴런에서 GCaMP 형광을 기록합니다.

예제 프로토콜에서는 후각 연상 학습 중 뇌의 버섯체에서 반응을 시각화하는 데 GCaMP 기능 이미징이 사용되는 것을 볼 수 있습니다.

- GFP 기반 칼슘 지시약의 시각화를 위해 진동 차단 테이블에 설치된 적외선 레이저와 침수 대물렌즈가 장착된 다광자 현미경의 레이저를 920나노미터의 여기 파장으로 조정하고 GFP 대역 통과 필터를 설치합니다. 거친 Z 조정 손잡이를 사용하여 뇌의 z축을 스캔하여 관심 있는 뇌 영역을 찾습니다. 자르기 기능을 사용하여 관심 영역에만 스캔의 초점을 맞춰 스캔 시간을 최소화하고, 머리의 앞쪽이 아래를 향하도록 스캔 보기를 회전합니다. 그런 다음 프레임 크기를 512 x 512 픽셀로 조정하고 각 프레임에 대해 계산된 스캔 시간을 고려하여 최소 4Hz의 프레임 속도를 달성하여 스캔할 영역을 선택합니다.

악취 유발 칼슘 과도 시각화의 경우, 이미지 획득 소프트웨어와 악취 전달 프로그램을 연결할 수 있는 사전 프로그래밍된 매크로 패키지를 시작하고 현미경 소프트웨어에서 6.25초 동안 측정을 시작하여 F0 기준선 값을 설정합니다. 냄새 전달 시스템에서 특정 냄새 컵 밸브의 개폐에 의해 트리거되는 LED 조명으로 표시되는 2.5초의 냄새 자극을 전달한 다음 냄새 오프셋이 끝날 때 12.5초 동안 기록합니다. 그런 다음 같은 방식으로 두 번째 및 세 번째 냄새 물질에 대한 전달을 반복합니다.

이 설정에서 연관 컨디셔닝을 수행하려면 컴퓨터 제어 냄새 전달 시스템을 사용하여 12개의 90볼트 전기 충격과 함께 60초 동안 조건화된 자극과 냄새를 표시합니다. 60초 휴식 후 전기 충격 없이 60초 동안 냄새를 뺀 상태 자극을 제시합니다. 훈련 단계를 마친 후 3분 후에 훈련 전 냄새 자극 프로토콜을 반복하여 훈련 후 냄새가 유발하는 칼슘 과도 현상을 다시 측정합니다. 그런 다음 나중에 이미지 분석을 위해 이미징 파일을 적절한 형식으로 저장합니다.