Single Worm PCR: 게놈 DNA를 추출하고 증폭하는 방법

- 단일 웜 PCR 분석의 경우, 자웅동체 웜이 자가 수정을 하고 유전적으로 동일한 자손을 생산할 수 있는 난자를 낳도록 하여 변형된 균주의 사본을 보존하도록 합니다. 그런 다음 부모를 웜 용해 완충액이 들어 있는 튜브로 옮깁니다.

튜브를 섭씨 영하 80도에서 얼려 큐티클이나 바깥층을 부수십시오. 샘플을 섭씨 60도로 가열하여 기생충 세포를 용해시켜 세포의 게놈 DNA와 함께 세포 내 단백질을 방출합니다. 이 온도에서 완충액 내의 단백질 분해 효소 K는 단백질, 특히 게놈 DNA를 파괴할 수 있는 뉴클레아제를 분해합니다.

그런 다음 온도를 섭씨 95도까지 올려 효소를 비활성화합니다. 마지막으로, 반응 완충액, dNTP, 관심 영역에 대한 순방향 및 역방향 프라이머, taq 중합효소 및 물로 구성된 PCR 마스터 믹스가 있는 튜브에 세포 용해물을 추가하여 반응을 원하는 최종 부피로 만듭니다. PCR을 수행하려면 관심 DNA 영역을 증폭하는 적절한 열 순환기 프로그램을 실행합니다.

다음 예에서는 단일 F1 웜의 게놈 DNA에서 CRISPR-Cas9 편집 이벤트를 스크리닝하는 PCR 절차를 볼 수 있습니다.

- 알을 낳은 지 1-2일 후, 웜 사진을 사용하여 F1을 7마이크로리터의 따뜻한 용해 완충액이 들어 있는 개별 PCR 스트립 튜브 캡으로 옮깁니다. PCR 튜브를 최대 속도와 실온에서 1분 동안 원심분리하여 동물을 튜브 바닥으로 가져옵니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 영하 80도에서 1시간 동안 얼립니다.

다음으로, 다음 프로그램을 사용하여 열 순환기에서 얼어붙은 벌레를 용해합니다. 그런 다음 이 표와 같이 PCR 마스터 믹스를 설정합니다.

21마이크로리터의 PCR 마스터 믹스를 깨끗한 PCR 튜브에 추가합니다. 그런 다음 4마이크로리터의 웜 용해 튜브를 넣고 피펫팅으로 잘 섞습니다.

그런 다음 제조업체의 지침에 따라 PCR 프로그램을 실행합니다.