Caenorhabditis elegans의 단일 세포 해리: 살아있는 세포를 분리하는 방법

0 조회수4:51 • April 30th, 2023

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- 세척된 펠릿 웜으로 시작하여 세제인 SDS와 환원제인 DTT가 포함된 용해 완충액을 추가합니다. 이것은 기생충의 보호 표피를 분해하여 세포 해리를 위해 몸을 노출시킵니다. 세포 용해 및 사멸을 최소화하기 위해 용해 완충액에 장기간 노출되지 않도록 하십시오.

다음으로, 저온 분리 버퍼를 여러 번 세척하여 용해 시약을 제거합니다. 이 완충액이 세포 사멸을 방지하기 위해 올바른 삼투압을 갖는 것이 중요합니다. 프로테아제 효소를 사용하여 세포 간 연결을 분해합니다. 기계적 에너지와 함께 균질화 과정을 돕기 위해 혼합물을 튜브 벽에 피펫팅합니다.

효소 반응을 멈추기 위해 혈청이 포함된 배지를 추가하고 오염을 방지하기 위해 항생제를 추가합니다. 대부분의 파편을 제거하기 위해 샘플을 여러 번 펠릿으로 만들고 세척하십시오.

마지막으로 튜브를 얼음 위에 올려 중력 침전을 허용합니다. 큐티클의 잔해나 세포 덩어리를 포함한 파편은 가라앉고 해리된 세포는 배지의 최상층에 부유합니다. 이러한 세포는 단기 배양에 사용하거나 FACS 또는 면역침전으로 특정 세포 집단을 분리하는 데 사용할 수 있습니다.

예시 프로토콜에서는 관심 뉴런에서 GFP를 발현하는 형질전환 웜을 해리하여 해당 세포를 분리하고 분석합니다.

- 동물을 모은 후 1,600회 g으로 5분 동안 원심분리합니다. 모든 상등액을 제거하고 1ml의 M9 매체에 웜을 다시 현탁시킵니다. 서스펜션을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

1,600 회 g에서 5 분 동안 원심 분리기를 사용하여 벌레를 펠릿으로 만듭니다. 그런 다음 200마이크로리터의 SDS-DDT 완충액을 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 이제 기생충은 광학 현미경으로 보면 몸을 따라 주름진 것처럼 보일 것입니다.

다음으로, 800마이크로리터의 얼음처럼 차가운 분리 버퍼를 추가하고 튜브를 부드럽게 튕겨 혼합합니다. 13,000 회 g과 섭씨 4도에서 1 분 동안 원심 분리기를 사용하여 벌레를 펠릿으로 만듭니다. 상층액을 제거하고 1ml의 분리 완충액으로 세척합니다.

이 원심분리 및 세척 과정을 총 5회 반복하고 매번 분리 버퍼를 조심스럽게 제거해야 합니다. 그 후, 분리 완충액에 용해된 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)의 프로테아제 혼합물 100마이크로리터를 펠릿에 첨가합니다.

실온에서 10-15분 동안 배양합니다. 200 마이크로리터 마이크로피펫 팁을 튜브 바닥에 대고 60-70회 위아래로 피펫팅하여 기계적 중단을 가해야 합니다. 분해 단계를 결정하려면 분해 혼합물의 1-5 마이크로 리터를 제거하고 유리 슬라이드에 떨어 뜨린 다음 조직 배양 현미경을 사용하여 검사하십시오.

5-7분이 지나면 기생충 조각의 큐티클이 눈에 띄게 줄어들고 세포 슬러리가 쉽게 보일 것입니다. 10% FBS와 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 시판되는 Leibovitz의 L15 배지 900마이크로리터를 첨가하여 반응을 중단합니다.

10,000 배 g과 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리기를 하여 분리된 단편과 세포를 펠릿화합니다. 세척당 15ml의 배지를 사용하여 차가운 L15 보충 매체로 펠릿화된 세포를 두 번 더 세척합니다. 펠릿화된 세포를 L15 보충 배지 1ml에 다시 현탁시키고 얼음 위에 30분 동안 그대로 둡니다.

그런 다음 약 700-800마이크로리터의 최상층을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 자동 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 10-25마이크로리터의 분리된 세포의 세포 밀도를 측정합니다.

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