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- 먼저 카르베니실린과 1밀리몰 IPTG를 추가하여 S 기저 배지가 포함된 배양 플라스크를 제어하고 테스트합니다. 성장 단계 1의 유충(L1 유충이라고도 함)이 들어 있는 튜브를 몇 분 동안 돌립니다. 이제 상등액을 제거하고 한천 플레이트에 2 마이크로 리터의 L1을 놓습니다. 해부 현미경 아래에 플레이트를 놓고 유충의 수를 세십시오.
비특이적 RNAi 플라스미드를 운반하는 RNAi 박테리아를 대조 플라스크에 추가하고 유전자 표적 RNAi를 가진 박테리아를 테스트 플라스크에 추가합니다. 추가되는 박테리아의 양은 벌레의 수에 비례해야 합니다.
유충이 적절한 산소 공급을 보장하기 위해 계속 흔들면서 자라도록 하십시오. 유충은 박테리아를 먹습니다. 유충 내부에서 작은 간섭 RNA는 표적 유전자에 의해 생성된 상보적 mRNA에 결합하여 단백질 발현을 억제합니다. 마지막으로, 관심 있는 표현형에 대해 벌레를 검사합니다.
예시 프로토콜에서는 액체 배양에서 daf-2 유전자를 표적으로 하는 RNAi로 L1 유충을 처리합니다.
- 처리를 시작하려면 2,800ml의 Fernbach 배양 플라스크에 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 추가 시약과 함께 207.45ml의 S 기저 배지를 추가합니다. 카르베니실린 밀리리터당 50마이크로그램과 IPTG 1밀리몰의 최종 농도를 추가하고 멤브레인 나사 캡으로 플라스크를 닫습니다.
섭씨 25도의 인큐베이터에서 L1을 꺼내 15ml 튜브로 옮깁니다. L1을 1,900회 g에서 3분 동안 원심분리합니다. 탈수 후 상층액을 제거하십시오. 현미경으로 2마이크로리터당 L1을 세고 최소 9방울에서 얻은 수치의 평균을 구합니다.
다음으로, 어린 지렁이 수집을 위한 50,000마리의 지렁이와 숙성된 지렁이 수집을 위한 100,000마리의 지렁이를 이전 단계에서 준비한 4개의 Fernbach 배양 플라스크에 추가합니다. 그런 다음 관심 유전자에 대한 대조군 RNAi 박테리아와 RNAi 박테리아를 벌레의 수에 비례하여 추가합니다.
박테리아를 첨가한 후 S 기저로 지렁이 배양을 완료하여 총 부피를 300ml로 만듭니다. 채취 할 때까지 150 RPM의 진탕 인큐베이터에서 섭씨 25도의 기생충 배양을 배양합니다.
