Name: 한 단계 Metabolomics : 탄수화물, 단일 절차 계량 유기 및 아미노산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-25T17:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 학습하세요 GC/MS를 이용한 한 단계 대사체 분석법으로 탄수화물, 유기산, 아미노산을 동시에 정량하는 방법입니다. 이 기술은 신생아 선별검사에서 유전성 대사질환을 추가로 38% 더 진단할 수 있습니다.

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소변 샘플 처리 절차 <ol><li> 37 ° C의 물을 욕조에 소변 샘플을 해동. 원본이 손상 됐다면 새 용기에 가만히 따르다. </li><li> 샘플 13 ML 최대 나누어지는를 타고 표시 원뿔 원심 분리기 튜브에서 -20 ° C에서 그것을 저장합니다. </li><li> 측정 및 굴절계의 소변 방울의 커플을 배치하여 시료의 광학 밀도를 기록합니다. </li><li> 0.2 음 필터를 통해 샘플을 필터링합니다. </li><li> 광학 밀도에 따라 아래의 샘플의 볼륨을 측정 <table border="0"><tbody><tr><td> 1.000-1.009 </td><td> 1.00 ML </td></tr><tr><td> 1.010-1.019 </td><td> 0.50 ML </td></tr><tr><td> 1.020-1.050 </td><td> 0.25 ML + 0.25 ML H 2 O </td></tr></tbody></table></li><li> ; 10 nmoles D 3 Methylmalonic 산성, 100 nmoles 다음 13 C 3 락트 산의 각 13 C 3 pyruvate, 13 C 2 15 500 nanomoles (nmoles) 3 크레아틴 : 지정된 볼륨이 다음 내부 표준을 포함하는 Reactivial로 전송됩니다 N 글리신, 세린 D 3, D 5 페닐알라닌, D 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotate, D 4 sebacic 산성, 13 C 6 포도당, D 6 이노시톨 및 D 5 트립토판. </li><li> 7.5 단위 / urease의 μl 솔루션 (Calzyme 연구소 카탈로그 안돼. 116A0100) 20 microliters는 (μl) 다음 플러시 및 불활성 심장을 통해 CO 2에 따라 봉인있는 예제에 추가됩니다. </li><li> 더 많은 이산화탄소 가스를 30 분 압력을 유지 15 분 간격으로 추가 ° C가 샘플은 37에서 열립니다. </li><li> urease 솔루션 20 μl 이상은 유리병이 이산화탄소로 플러시이며, 추가 및 예제는 또 다른 15 분 동안 37 ° C에서 관리하고 있습니다. </li><li> 30:70 아세톤 500 μl : 메탄올이, 추가 고무 심장이 테플론 코팅 심장으로 대체되며, 샘플은 15 분 -20 ° C에서 차게됩니다. </li><li> 고체는 다음 깨끗한 2.0 CC Reactivial (Supelco / 시그마)에 decanted 1500 RPM X 10 분 원심 분리에 의해 제거됩니다 </li><li> 다음과 같이 triethylammonium의 trifluoroacetate (차 / TFA) (시그마)를 추가합니다 <ul><li> 1.00 ML 시료 20 μl </li><li> 0.5 ML, 이하, 시료 40 μl </li></ul></li><li> 70 질소 기류 하에서 acetonitrile과 장소에서 최고 ° C 일정한 볼륨이 달성 때까지 (차 / TFA가 유지됩니다) (~ 15 분). </li><li> 침전 양식 (~ 10 분마다)까지, 4까지 시간을 단계 13를 반복합니다. </li><li> 약 2 분 동안 식지. (~ 4:00 분) 이상의 종기에주의하고, 건조되고, 메틸렌 클로라이드로 내려 톱. </li><li> 15 단계를 반복합니다. </li><li> 다음과 같은 속도로 MSTFA (N - 메틸 - N - trimethylsilyltrifluoroacetamide) (과학 열)를 추가합니다 <ul><li> 1.00 ML 시료 150 μl </li><li> 0.50 ML, 이하, 시료 200 μl </li></ul></li><li> 70 질소 분위기와 부화 이하 총액 ° 1 시간 C. </li><li> 가스 크로마토 그래프 / 질량 분석계에 대한 분석, 질소 분위기에서 microvials로 전송합니다. </li><li> 애질런트 5975 GC / MS에 의해 자동 분사에 대한 플레이스 microvials : 악기 온도는 다음과 같습니다 주입기 200 ° C, 인터페이스 250 ° C, 오븐 80 ° 1 분 C, 4 램프 ° C / 분 80-130 ° C, 램프에 6 ° C / 분 130-200 ° C, 12 ° C 램프 / 분 200-285 ° C, 10 분 만요. 칼럼 : 25m, 320 마이크론 ID, 0.5 미크론 필름 두께 DB - 5. 질량 분석기 : 소스 230 ° C, 쿼드 150 ° C, 2.46 스캔 / 초에서 스캔 50-650 AMU. 솔벤트 지연 3.5 분. </li></ol> 대표 결과 주시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2014/ShoemakerResultHawkinsinuria.pdf">여기를 클릭</a> 대표 결과를 볼 수 있습니다.

<ol><li>Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+urine+samples+for+carbohydrates%2C+organic+and+amino+acids+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease.</a> J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).</li>
<li>Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+gas+chromatographic-mass+spectrometric+screening+of+newborn+urine+for+inborn+errors+of+metabolism+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).</li>
<li>Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+organic+acidemia+using+GC%2FMS+and+dried+urine+filter+paper%3A+a+study+on+neonatal+mass+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum+Dev%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening.</a> Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+gas+chromatographic-mass+spectrometric+procedure+for+diagnosing+pyrimidine+degradation+defects+for+prevention+of+severe+anticancer+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).</li>
<li>Kuhara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+inborn+errors+of+metabolism+using+filter+paper+urine%2C+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).</li>
<li>Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+simplified+and+sensitive+method+for+screening+fructose-1%2C6-diphosphatase+deficiency+by+analyzing+urinary+metabolites+in+urease%2Fdirect+preparations+and+gas+chromatography-mass+spectrometry+in+the+selected-ion+monitoring+mode%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diagnosis+of+homocystinuria+by+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).</li>
<li>Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).</li>
<li>Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+Drosophila+a+biotin-deficient+diet+for+multiple+generations+increases+stress+resistance+and+lifespan+and+alters+gene+expression+and+histone+biotinylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns.</a> J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).</li>
<li>Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Importance+of+NADP%2B-Dependent+Isocitrate+Dehydrogenase+in+Resistance+to+Nitrosative+Stress+and+the+Inessentiality+of+Glucose-6-Phosphate+Dehydrogenase+for+Oxidative+Stress+Resistance+in+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryotic Cell. , (2010).</li>
<li>Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Screening+in+Humans+by+Gas+Chromatography-Mass+Spectrometry+of+Urine+Metabolites+After+Substrate+Loading%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading.</a> , (1992).</li>
<li>Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproate-induced+biochemical+abnormalities+in+pregnancy+corrected+by+vitamins%3A+A+Case+Report%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report.</a> Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+folate-dependent+metabolite+in+amniotic+fluid+from+pregnancies+with+normal+or+trisomy+21+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes.</a> Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acid+concentrations+in+amniotic+fluid+found+in+normal+and+Down+syndrome+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridoxine-related+metabolite+concentrations+in+normal+and+Down+syndrome+amniotic+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).</li>
</ol>

신진 대사 선별 연구소는 세인트 루이스 대학, 비영리 법인이 소유한 CLIA - 라이선스 임상 연구소입니다. 슈메이커 박사는 실험실의 수익에서 직접 수익을하지 않지만 실험실 생산성의 간접적 혜택을 수도 있습니다. 방법, 기술, 결과, 정상 범위, 매크로, 소프트웨어, 라이브러리 또는 결론의 아무도 독점적인 것으로 간주되지 및 이해 관계자에게 자유롭게 사용할 수 있습니다.

urease 방법 (1) 다양한 수정 의료 문학에서 62 번 언급되었습니다. 마츠모토의 그룹 (2,3)은 높은 처리량 신생아 검사에 대한 절차를 단순화하고 16,000 환자에서 결과를 발표했다. Kuhara 및 기타 (4-7)은 타고난 오류 진단의 여러 경우에 방법의 사용을보고하고 후속있다. 르헤드 (8) 또한 임상 진단 방법의 유틸리티를 확인하고 후속 타고난 오류. 방법은 전체 과일 파리와 그 유충 (9)의 마우스, 코끼리와 homogenates을 뺏으 곰의 소변에 적용되었습니다. 사이트 감독의 돌연변이 유발 전후 Cryptococcus의 문화 미디어도 urease 단계 (10)없이 분석했다. 방법은, 트립토판과 메티오닌 이소 류신 아미노산 (11)의 경구 복용으로 과목을 로딩 후 증후군 환자와 미친 노인 퇴역 군인 다운, 의대생 인간의 영양 평가에 적용되었습니다. 몽땅 B - 비타민은 그들 가운데 자신의 저하 특정 시점에 총 8 개의 비타민을 필요로, 세 가지 아미노산의 분해 제품을 quantifying에 의해 평가되었다. 비타민 보완하여 의약품과 완화의 독성 효과 (12)보고되었습니다. 정상 및 다운 증후군의 임신에서 양수 샘플 분석 및 (13-15)보고되었다.

<table><tbody><tr><td>MSD 5975</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/컴퓨터</td></tr><tr><td>MSD 5973</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/컴퓨터</td></tr><tr><td>우레아제(Urease)</td><td>Calzyme</td><td>116A0100</td><td>Sigma C3 제품도 해당됨</td></tr><tr><td>안정 동위원소 표준물질</td><td>CDN Isotopes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>용매</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분석물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC 컬럼</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>123-5026</td><td></td></tr><tr><td>TEA/TFA</td><td>Fluka</td><td>09747</td><td></td></tr><tr><td>바이알</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>Z115088/12EA</td><td></td></tr><tr><td>Merlin Microseal</td><td>Agilent Technologies</td><td>5181-8815</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA</td><td>Thermal Scientific, Inc.</td><td>48913</td><td></td></tr></tbody></table>

한 단계 metabolomics : 탄수화물, 단일 절차 계량 유기 및 아미노산

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

미국에서 태어난 모든 아기는 이제 &#39;대사 타고난 오류 &quot;라는 희귀한 유전 질환 42까지에 대한 검사를합니다. 심사 방법은 탠덤 질량 분석계에 기초하고 있으며 유기 acidemias을위한 화면으로 acylcarnitines을 단정 또한 아미노산을 측정합니다. 모든 상태는 또한 갈락토 오스 혈증과 같은 탄수화물 장애에 대한 효소 테스트를 수행합니다. 결과가 될 수 있기 때문에 긍정적인 결과가 아닌 특정 후속 테스트는보다 확실한 방법을 사용해야합니다. 현재 보고서는 타고난 오류 검사를위한 샘플 준비의 &quot;urease&quot;방법을 설명합니다. 결정 urease 효소는 대부분의 다른 수용성 metabolites가 한 프로 시저에서 가스 크로마 토그래피를위한 탈수 및 derivati​​zed 수 수 체액에서 요소를 제거하는 데 사용됩니다. 질소 스트림의 증발에 의해 탈수가 acetonitrile과 염화 메틸렌을 추가하여 용이합니다. 그러면 trimethylsilylation는 독특한 촉매, triethylammonium의 trifluoroacetate의 존재에 이루어진다. 자동 분사와 크로마 토그래피는 192 metabolites와 TMS derivati​​zed 생물 학적 화합물의 질량 스펙트럼의 전문 라이브러리를 사용하여 모든 주요 구성 요소의 세미 부량의 매크로 기반의 사용자 정의 부량옵니다. 분석은 저자에서 사용할 수있는 매크로와 라이브러리를 사용하여 널리 사용 Chemstation 플랫폼에서 수행할 수 있습니다. , 샘플 결과의 17 % 주문에 의해 의사에 따라 행동해야 결과를 공개입니다 - 우리 연구실에서 16,000 이상의 환자 샘플을 17 % 정도의 진단 항복과 함께 방법을 사용하여 분석하고 있습니다. 38 %가 이전의 방법을 사용하여 진단되지 않았을 수있는 180 확인 타고난 오류, 이상이 포함되어 있습니다.

중간 metabolites의 GC / MS 분석을위한 샘플 준비 urease 방법은 그 발명가에 의해 제공됩니다. 방법은 허용 한 단계 모두 단일 프로세스에서 quantifying 탄수화물, 유기 및 아미노산의 탠덤 질량 분광법에 의해 타고난 오류에 대한 신생아 선별의 후속.

한 단계 Metabolomics : 탄수화물, 단일 절차 계량 유기 및 아미노산

현재 미국에서 태어나는 모든 영아는 "선천성 대사 이상"이라고 불리는 최대 42가지의 희귀 유전 질환에 대해 스크리닝 검사를 받습니다. 이 스크리닝 방법은 ...에 기반합니다.

이 단일 단계 대사체학 절차에서는 가스 크로마토그래피 질량 분석법을 통해 탄수화물, 유기산 및 아미노산을 분석하기 위한 생물학적 시료 준비가 한 번의 과정으로 수행됩니다. 먼저 시료를 urease 효소로 처리하여 urea를 제거합니다. 절차의 두 번째 단계는 두 가지 휘발성 성분인 triathlon, ammonium 및 tri fluoro acetate로 구성된 세제 존재 하에 시료를 탈수시키는 것입니다.그 다음으로 트리메틸화를 통해 성분들을 유도체화합니다. 마지막으로 가스 크로마토그래피-질량 분석법을 통한 분석과 탄수화물, 유기산 및 아미노산, 이소류신, 글리신, 아미노당의 자동 정량을 통해 신생아 스크리닝에서 발견되는 대부분의 유전 질환과 현재 탠덤 질량 분석법으로는 스크리닝되지 않는 추가 38%의 질환을 확인하고 추적 관찰할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 세인트루이스 대학교 대사 스크리닝 연구소의 Jim Shoemaker입니다.저는 산, 염기 및 중성 화합물을 분리하지 않고 생체 시료 내의 중간 대사물을 분석하는 방법인 원스텝 메타볼로믹스(one step metabolomics)를 시연하고자 합니다. 이 방법을 통해 탠덤 질량 분석법을 이용한 신생아 스크리닝 이후, 단 한 번의 절차만으로 유기산, 아미노산, 탄수화물, 탄수화물 유도체 및 아실글리신(acylglycine)을 모두 분석할 수 있습니다. 결과적으로 제 뒤의 그래프에서 보시는 바와 같이, 빨간색으로 표시된 진단명들은 원스텝 메타볼로믹스를 통해 진단이 가능하지만, 현재의 탠덤 질량 분석 기반 신생아 스크리닝으로는 검출되지 않았을 항목들입니다.이제 시연을 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 소변 샘플을 37 °C 항온수조에서 가온하십시오. 원래 용기가 손상되었다면 샘플을 새 용기에 옮겨 담으십시오.샘플의 일부를 취해 라벨이 부착된 원추형 원심분리 튜브에 넣고 -20 °C에서 백업용으로 보관하십시오. 다음으로, 휴대용 굴절계에 소변을 두어 방울 떨어뜨려 샘플의 광학 밀도를 측정하고 기록하십시오. 광학 밀도 측정이 끝나면 샘플을 0.2 micron 필터로 여과하십시오.여과 전 측정된 광학 밀도에 따라 시료의 부피를 측정하십시오. 값이 1에서 1.009 사이인 경우 시료 1 mL를 사용하고, 1.01에서 1.019 사이인 경우 시료 0.5 mL를 사용하십시오. 1.02에서 1.05 사이의 값인 경우에는 시료 0.25 mL와 물 0.25 mL를 혼합하여 사용하십시오.정해진 부피를 여기에 표시된 표에 명시된 동위원소 표지 내부 표준 물질이 이미 들어 있는 반응 바이알로 옮깁니다. 표준 물질에는 creatine, methylmalonic acid, lactate, pyruvate, glycine, sine phenyl alanine, hexa oil, glycine, orate, SEBA acid glucose, inositol 및 tryptophan이 포함됩니다. 그런 다음 7.5 units/µL 농도의 urease 용액 20 µL를 첨가합니다.불활성 격막을 통해 이산화탄소로 시료를 세척하고 밀봉합니다. 37 °C에서 30분 동안 시료를 유지하며, 15분 간격으로 이산화탄소 가스를 추가하여 압력을 유지합니다. 30분 배양 종료 시점에 urease 용액 20 µL를 더 추가합니다. 바이알을 이산화탄소로 세척하고 37 °C에서 15분 더 시료를 유지합니다.urease 처리가 완료되면, 처리 직후 즉시 샘플의 탈수 및 유도체화 단계를 진행하십시오. 30~70 비율의 acetone 및 methanol 혼합 용액 500 µL를 샘플에 첨가하고, 고무 septum을 Teflon 코팅 septum으로 교체하십시오.샘플을 -20 °C에서 15분 동안 냉각합니다. 1500 RPM에서 10분 동안 원심분리하여 고형물을 제거한 다음, 상층액을 깨끗한 2.0 CC 반응 바이알에 옮겨 담습니다. 이제 트리메틸화 촉매인 tri ammonium, tri fluoro acetate(TFA)를 첨가하는데, 1 mL 샘플의 경우 20 µL를, 0.5 mL 이하 샘플의 경우 40 µL를 첨가합니다.아세토니트릴을 채운 후 70 °C의 질소 기류 하에 두어 부피가 일정해질 때까지 유지하며, 이는 T-E-A-T-F-A만 남았음을 나타냅니다. 이 과정은 약 15분 정도 소요됩니다. 다시 아세토니트릴을 채우고 70 °C의 질소 기류 하에 두어 부피가 일정해질 때까지 반복하며, 침전물이 형성될 때까지 이 과정을 최대 4회까지 반복합니다.탈수 후 매회 약 10분이 소요되며, 약 2분 동안 식힙니다. 끓어 넘치지 않도록 주의하며 메틸렌 클로라이드를 가득 채운 후 건조합니다. 이 과정은 약 4분이 소요됩니다.메틸렌 클로라이드를 가득 채운 후 건조하십시오. 이 과정을 한 번 더 반복합니다. 다음으로, 시료를 유도체화하십시오.1 mL 샘플에는 150 µL의 OFM, STFA를 추가하고, 0.5 mL 이하의 샘플에는 200 µL를 추가합니다. 질소 분위기 하에서 샘플 캡을 닫고 70 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간의 배양 과정이 끝나면, 질소 분위기 하에서 샘플을 마이크로 바이알로 옮겨 가스크로마토그래피 질량분석기로 분석합니다. 본 과정에서는 DB-5 모세관이 장착된 Agilent 5975 GCMS를 사용하였습니다.질량 분석기의 경우, 소스를 230 °C로, 쿼드러폴을 150 °C로 설정하고, 스캔 질량 범위를 초당 2.46회 스캔 속도로 50에서 650 AMU로 설정하십시오. 용매 지연 시간은 3.5분입니다. 기기 온도는 인젝터 200 °C, 검출기 250 °C로 설정합니다.인터페이스의 경우, 오븐을 80 °C로 1분 동안 설정한 다음, 80 °C에서 130 °C까지 분당 4 °C의 속도로 승온하고, 이어서 130 °C에서 200 °C까지 분당 6 °C의 속도로 승온하며, 마지막으로 200 °C에서 285 °C까지 분당 12 °C의 속도로 승온한 후 10분 동안 유지합니다. GCMS 자동 주입을 위해 deriv eye 샘플이 담긴 마이크로 바이알을 배치하고 분석을 시작합니다. Urease 처리 후 GCMS로 분석한 소변 샘플의 대표 스펙트럼이 여기에 제시되어 있으며, 대사물질인 pyro glutamic acid, four hydroxy cyclo acetic acid 및 hawkinson에 해당하는 피크가 표시되어 있습니다.이러한 대사물질들은 희귀 유전 질환인 Hawkins Anuria의 지표가 됩니다. 스펙트럼의 모든 피크는 알려진 대사물질로 할당되어 정량화될 수 있습니다. 초기 신생아 선별 검사 결과는 비특이적일 수 있습니다.하지만 여기에서 보여준 것과 같이 GCMS로 분석한 소변 샘플에서 Hawkins UR 대사산물의 수치가 상승한 것이 확인되어, 이 선천성 대사 이상 질환의 진단이 확정되었습니다. 동일한 URIs 방법을 사용하여 184명의 환자에게서 선천성 대사 이상이 진단되었습니다. 빨간색으로 표시된 진단 사례의 약 40%는 신생아 스크리닝에 일반적으로 사용되는 탠덤 질량 분석법으로는 진단되지 않았을 것입니다.지금까지 동일한 절차 내에서 탄수화물, 유기산, 아미노산 및 acyl glycine을 분석하기 위해 urease 방법을 사용하는 원스텝 메타볼로믹스 수행 방법을 시연하였습니다. 절차의 효율성을 평가할 때, urease 소화, 탈수 및 trimethyl silylation의 완결성 여부를 모두 확인할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이는 모든 내부 표준물질의 존재 여부를 확인하는 것만으로 가능합니다.내부 표준물질은 예를 들어 탈수 과정이 완전히 진행되었음을 입증하기 위해 의도적으로 선택되었습니다. 만약 탈수가 완전히 이루어지지 않았다면, creatinine TRI TMS가 전체 양으로 존재하지 않았을 것이기 때문입니다. 이것이 저희의 입증 방식입니다. ChemStation을 사용하여 이 절차를 해석하기 위해 저희가 개발한 매크로와 라이브러리에 관심이 있으시다면 화면에 표시된 주소로 이메일을 보내주시기 바라며, 저희 연구소에 대한 더 자세한 정보는 화면의 URL에서 확인하실 수 있습니다.대단히 감사합니다. Jim Shoemaker입니다.

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