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생물학
0 조회수 • 5:51 분 • April 30th, 2023
- 살아있는 초파리 배아를 수집하고 투명하지 않은 융모를 제거합니다. 그런 다음 유리 커버슬립에 액체 헵탄에 용해된 테이프 접착제인 헵탄 접착제 라인을 바릅니다. 이제 제거된 배아를 처리할 수 있으려면 표본을 접착제에 일렬로 조심스럽게 정렬합니다.
커버슬립을 탈수 챔버로 옮겨 배아를 부분적으로 건조시킵니다. 이렇게 하면 주사 중 또는 주사 후에 세포질 누출을 방지할 수 있습니다. 다음으로, 커버슬립을 제거하고 배아를 할로카본 오일로 덮어 산소가 배아로 확산되도록 하면서 추가 탈수를 방지합니다.
미세주입을 수행하려면 호환 가능한 현미경에서 미세주입 시스템을 사용하십시오. 눈 조각을 통해 배아와 주사 용액이 미리 로드된 바늘을 모두 식별합니다. 바늘을 부러뜨려 열고 일관되고 적절한 크기의 액체 방울이 생성되는지 확인합니다. 그런 다음 바늘을 배아 안으로 가져와 적절한 양을 주입합니다. 바늘을 꺼내고 다음 바늘로 진행하여 나머지 배아에 대해 주사를 반복합니다.
예제 프로토콜에서는 세포 분열의 라이브 이미징 연구를 위한 Drosophila 배아 미세주입의 시연을 볼 수 있습니다.
- 커버 슬립을 설정하기 전에 이중 접착 테이프를 풀고 100 밀리리터 병에 넣어 헵탄 접착제를 만듭니다. 약 50ml의 헵탄가를 넣고 병을 밀봉한 다음 며칠 동안 흔듭니다.
배아를 준비하기 전에 주입 전에 배아를 놓을 탈수 챔버를 만드십시오. 이렇게하려면 35mm 페트리 접시 안에 100mm 접시의 한 부분을 넣어 "테이블"을 만듭니다. 무수 황산칼슘인 드리라이트를 그 주위에 추가하여 드리어라이트의 높이가 "테이블"보다 높지 않도록 하고 덮습니다.
배아 준비를 시작하려면 먼저 매시간 포도 주스 플레이트를 효모로 교체하여 레이 케이지에서 배아를 채취하십시오. 배아는 채취 시작 후 약 2시간 후에 이미지화해야 합니다. 커버슬립을 준비하려면 현미경 슬라이드의 한쪽에 놓고 네 모서리를 테이프로 붙여서 움직이지 않도록 합니다.
면봉 어플리케이터를 사용하여 헵탄 접착제 한 층을 커버 슬립에 한 줄로 놓습니다. 접착제는 점성이 없어야 하며 몇 초 안에 건조되어야 합니다. 너무 두꺼우면 헵탄을 더 넣으십시오.
마지막으로 커버슬립 옆의 슬라이드에 이중 접착 테이프를 붙입니다. 적신 브러시로 포도 주스 접시에서 배아를 조심스럽게 집어 슬라이드의 이중 접착 테이프에 놓습니다.
다음으로, 핀셋의 절반을 사용하여 융삭막이 끊어질 때까지 이중 접착 테이프 위로 배아를 굴립니다. 배아를 융모막 위로 부드럽게 굴려 핀셋에 달라붙도록 배아를 집어 올리고, 배아의 긴 면이 덮개 슬립의 긴 면과 평행이 되도록 덮개 슬립의 헵탄 접착제 위에 놓습니다.
10-20개의 배아를 한 줄로 놓습니다. 커버슬립을 제거하고 3-8분 동안 탈수실에 넣습니다. 시간은 현지 습도와 주입할 양에 따라 다릅니다. 다음으로, 진공 그리스가 있는 금속 챔버에 커버슬립을 놓습니다. 마지막으로, 추가 탈수를 방지하기 위해 배아를 할로카본 오일로 덮습니다. 이제 배아를 주입할 준비가 되었습니다.
먼저, 16X 대물렌즈 아래에서 배아를 찾습니다. 배아를 멀리 옮기고, 초점면을 움직이지 않고 바늘을 찾는다. 바늘을 중앙에 놓고 X 또는 Y 방향으로 움직이지 않고 위로 이동합니다.
바늘을 열려면 커버슬립의 가장자리를 시야에 넣되 바늘이 있을 곳이 아닌 곳에 놓고 바늘을 동일한 초점면으로 내립니다. 매우 조심스럽게 커버 슬립이 바늘에 닿을 때까지 움직여 부드럽게 부러뜨립니다. 바늘을 위로 움직입니다.
이제 배아를 시야에 가져와라. 바늘을 기름에 넣고 바늘에서 좋은 액체 방울이 나오도록 하십시오. 배아를 바늘 속으로 꾸준히 이동시키고, 배아에 한 방울을 주입한 다음, 배아를 멀리 이동시킨다. 모든 배아를 주입한 후에는 60 또는 100X 대물렌즈가 있는 컨포칼 현미경으로 관찰할 준비가 됩니다.