초파리 Activity Monitor (DAM): 파리의 운동 활동을 측정하는 방법

- 초파리 활동 모니터(DAM)는 한쪽 끝에는 파리 먹이가 장착된 중앙 활동 튜브가 있고 다른 쪽 끝에는 통기성이 있는 클로저가 있습니다. 이 설정은 며칠 또는 몇 주 동안 지속되는 실험 중에 단일 파리를 수용합니다.

DAM을 온도, 습도 및 조명 주기가 설정된 인큐베이터와 같은 통제된 환경에 배치합니다. 어두운 방에서 실험을 수행하고 필요한 경우 적외선 광원을 사용하여 밝은 빛과 달리 파리의 생체 시스템에 영향을 미치지 않는 장치를 처리합니다.

운동 활동을 기록하려면 DAM의 감지기에서 판독값을 저장하는 컴퓨터 시스템에 장치를 연결하십시오. DAM의 전자 장치는 각 튜브의 중간 지점을 통해 방출되는 적외선 빔의 무결성을 지속적으로 감지하고 주기적으로 컴퓨터 시스템에 데이터를 업로드합니다.

파리는 튜브 내부를 앞뒤로 걸으면서 적외선 빔을 교차합니다. 이러한 중단은 각 튜브에 대해 시간 경과에 따라 DAM에 의해 계산되며 파리 활동의 척도로 사용됩니다.

다음 프로토콜에서는 DAM 시스템을 사용하여 초파리 성인 남성의 일주기 리듬을 연구합니다.

- 파리를 활동 튜브에 넣기 전에 활동 모니터를 수용하는 데 사용할 인큐베이터를 켭니다. 인큐베이터 컨트롤을 사용하여 온도를 조정하고 원하는 실험 설계에 따라 DAM 시스템 조명 컨트롤러 또는 인큐베이터의 자체 조명 제어 시스템을 사용하여 명암 영역을 설정합니다.

다음으로 이산화탄소로 파리를 마취합니다. 그런 다음 고운 붓을 사용하여 파리 한 마리를 활동 튜브에 부드럽게 옮깁니다. 가는 집게로 약 1/2인치인 한 조각의 실 중간을 잡고 활성 튜브의 비식품 끝 부분에 실을 삽입하여 구멍을 막고 실험 중에 파리가 탈출하는 것을 방지하는 동시에 튜브로 공기 흐름을 허용합니다.

파리가 깨어날 때까지 튜브를 옆으로 눕혀 파리가 음식에 달라붙는 것을 방지하십시오. 활동 모니터에 튜브를 삽입합니다. TriKinetics 모니터의 더 새롭고 더 컴팩트한 모델에서는 적외선 빔이 중앙 위치에서 튜브를 통과하도록 고무 밴드로 튜브를 제자리에 고정해야 합니다.

마지막으로, 활동 모니터를 인큐베이터에 넣고 전화선을 통해 데이터 수집 시스템에 연결합니다. DAM 시스템 수집 소프트웨어를 사용하여 모든 모니터가 제대로 연결되어 있고 각 모니터에서 데이터가 수집되고 있는지 확인합니다.

이제 파리가 활동 튜브에 로드되고 운동 활동 모니터링 시스템이 준비되었으므로 이제 데이터를 기록할 수 있습니다. 파리는 2일에서 5일 동안 원하는 빛/어두움 또는 LD 및 온도 체제에 노출시켜 동기화되고 동반됩니다. 가장 일반적으로 사용되는 동반 조건은 섭씨 25도에서 12시간 밝음/12시간 어둡기의 밝음/어둡게 주기입니다.

이 프로토콜과 관련된 일주기 리듬 연구를 위해 인큐베이터에서 조명이 켜지는 시간은 zeitgeber time 0으로 정의되고 다른 모든 시간은 해당 값에 상대적입니다. 표준 12:12 LD 조건에서 야생형 Drosophila melanogaster는 일반적으로 두 번의 활동을 나타냅니다. 하나는 아침 피크라고 하는 ZT0를 중심으로 하고 다른 하나는 저녁 피크라고 하는 ZT12를 중심으로 합니다.

자유 실행 운동 활동 리듬은 동반 기간 후 일정한 어둡고 온도 조건에서 측정됩니다. 광주기에 대한 설정은 LD의 마지막 날에 어두운 단계에서 언제든지 변경할 수 있으므로 실험의 다음 날이 DD의 첫 번째 날을 나타냅니다. 7일간의 DD 데이터 수집은 파리의 일주기 주기와 진폭 또는 리듬의 강도를 계산하기에 충분합니다.

일반적으로 특정 유전자형에 대한 신뢰할 수 있는 자유 실행 기간을 얻으려면 최소 16마리의 파리의 표본 크기가 필요합니다. 실험이 끝나면 DAM 시스템 소프트웨어를 사용하여 수집된 원시 이진 데이터가 휴대용 데이터 저장 장치(예: USB 키)에 다운로드됩니다.

원시 이진 데이터는 DAM Filescan102X를 사용하여 처리되며, 일주기 매개 변수를 분석할 때 15분 및 30분 빈으로 합산되거나 수면/휴식 매개 변수를 분석할 때 1-5분 빈으로 합산됩니다. 현재 5분 연속으로 활동하지 않는 것이 초파리에서 수면/휴식의 표준 정의입니다.