표적 검증을 위해 중장 분리가 중요한 이유는 무엇입니까?

중장을 분리하면 장 줄기세포의 거동을 직접 연구할 수 있으며, 이는 장의 항상성 및 재생에 관여하는 표적을 검증하는 데 매우 중요합니다. 이는 조직 유지에 미치는 표적의 영향을 평가할 수 있는 질환 관련 시스템을 제공함으로써 기전적 리스크 감소(mechanistic de-risking)를 지원합니다.

해부가 발견 파이프라인에서 독립 변수 격리를 어떻게 지원합니까?

해당 해부 프로토콜은 전장, 후장, 말피기관과 같은 혼란 변수가 될 수 있는 조직들을 제거하여, 연구자가 분석을 위한 독립 변수로서 중장을 분리할 수 있게 합니다. 이를 통해 관찰된 표현형이 전신적 영향이 아닌 중장 특이적 과정에 의한 것임을 보장합니다.

중장 해리 후 FACS를 통해 어떤 정량적 측정이 가능한가요?

FACS를 통해 분리된 중장의 해리 후 장 줄기세포의 빈도, 생존율 및 마커 발현을 정량적으로 측정할 수 있습니다. 이러한 측정값은 어린 파리와 늙은 파리의 비교와 같이 실험 조건 간의 비교 분석을 뒷받침합니다.

교차 기능적 협업에서 재현성 요구 사항이 중요한 이유는 무엇인가요?

해부 프로토콜을 재현함으로써 중간gut의 품질과 수율을 일정하게 유지할 수 있으며, 이는 발견, 스크리닝 및 전임상 팀 간의 신뢰할 수 있는 데이터 공유를 위해 필수적입니다. 표준화된 재현은 가변성을 줄이고 교차 기능적 의사 결정에 대한 신뢰도를 높여줍니다.

이 방법을 구현하기 전에 어떤 통계 분석 능력이 필요한가요?

실행을 위해서는 조건별 줄기세포 수 또는 마커 양성률과 같은 중장 유래 지표를 비교할 수 있는 통계 도구가 필요하며, 이를 통해 유의미한 차이를 평가할 수 있습니다. 단독 중장 표현형에 기반한 진행 또는 중단(go/no-go) 결정을 내리는 데는 기본적인 비교 통계만으로도 충분합니다.

성충 파리에서 중장 해부: 소화관을 분리하는 방법

JoVE Encyclopedia of Experiments

생물학

0 조회수 • 3:06 분 • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- 시작하려면 마취된 성충 파리의 머리를 제거합니다. 목이 잘린 파리를 인산염 완충 식염수(PBS)와 소 혈청 알부민(BSA)이 함유된 용액으로 덮어 건조를 방지합니다. 집게로 파리의 흉부를 잡고 두 번째 집게로 복부를 당겨 장을 드러냅니다. 농작물 또는 식품 저장 자루가 흉부에 붙게 되므로 장을 흉부에서 부드럽게 당겨 빼냅니다.

일단 분리되면 복부에서 작물을 당겨 장을 펼칩니다. 파리의 뒤쪽 끝을 당겨 복강에서 장을 분리하기 시작합니다. 복부에서 전체 조직을 빼내기 위해 장을 계속 잡아당긴다. 일단 풀려나면 앞장, 말피기안세뇨관, 뒷장 및 난소를 제거하고 파리 내 주요 소화 부위인 절개된 중장만 남깁니다.

예시 프로토콜에서는 FAC(Fluorescence-Activated Cell Sorting)을 통해 추가 분석을 위해 어린 파리와 늙은 성충 파리의 내장을 해부할 것입니다.

- 해부를 시작하기 전에 표준 플라이 베드에서 이산화탄소가 든 파리 40마리가 든 바이알 하나를 마취합니다. 그런 다음 면도날을 사용하여 모든 파리의 목을 베고 아가로스 젤로 코팅된 해부 접시로 옮깁니다. 아가로스가 잠길 정도로 차가운 PBS와 BSA를 접시에 붓습니다. 파리가 떠다닐 것입니다.

그런 다음 각 곤충에 대해 한 쌍의 집게로 파리의 복부를 잡고 다른 집게로 흉부를 잡습니다. 흉부와 복부를 분리하십시오. 장이 보이고 작물은 여전히 흉부에 연결되어 있을 가능성이 큽니다. 내장을 잡고 흉부에서 빼냅니다. 그런 다음 작물을 잡고 장을 복부에서 약간 앞쪽으로 당겨 펼칩니다.

다음으로, 집게 중 하나를 사용하여 복부의 뒤쪽 끝을 잡고 다른 하나는 앞쪽으로 열린 큐티클의 가장자리를 잡습니다. 뒤쪽 끝을 당겨 큐티클을 끊고 장 전체가 복강에서 빠져나올 때까지 뒤쪽을 매우 부드럽게 계속 당깁니다. 앞창자, 말피기안관, 뒷창자, 난소를 제거하고 맨 중창자는 남겨둡니다.

중장이 분리되면 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 한 번에 여러 장 조직을 얼음 위의 차가운 PBS와 BSA가 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 주기적으로 옮깁니다.