칼슘 이미징: 살아있는 예쁜꼬마선충의 신경 활동을 시각화하는 방법

- 칼슘 감지 단백질인 GCaMP를 발현하는 형질전환 기생충 한 마리를 기생충을 위한 박테리아 먹이와 함께 이미징 챔버에 넣습니다. 그런 다음 증발을 방지하기 위해 뚜껑과 실험실 필름으로 접시를 밀봉하십시오. 광시야 에피형광(wide field epifluorescence)을 위한 복합 현미경으로 확인해 보세요. 이미징 소프트웨어를 사용하여 벌레의 행동을 추적하고 형광을 캡처하기 위해 벌레의 타임 랩스 이미지를 기록합니다.

형질전환 웜은 특정 뉴런에서 GCaMP 발현을 유도하는 프로모터의 제어 하에 GCaMP 센서 단백질을 발현합니다. 그 뉴런이 활성화되면 활동 전위를 발사하여 원형질막을 탈분극시킵니다. 탈분극 시, 전위의존성 칼슘 채널은 원형질막에서 열립니다. 이로 인해 칼슘 이온이 세포로 유입되어 신경 흥분이 발생합니다.

여기 뉴런의 GCaMP는 칼슘 이온과 결합합니다. 이로 인해 GCaMP는 저강도 형광 여기광으로 웜을 이미지화할 때 형광을 발합니다. 예제 프로토콜에서는 칼슘 이미징을 사용하여 아가로스 마이크로챔버에서 형질전환 C. elegans의 AVA 인터뉴런 활성을 시각화합니다.

- 칼슘 이미징은 광시야 형광을 위해 장착된 복합 현미경에서 수행됩니다. 광 노출을 제한하려면 카메라가 프레임을 녹화하는 동시에 LED를 트리거하여 샘플을 비추는 트랜지스터-트랜지스터 로직 신호를 사용하십시오.

15분에서 30분마다 각 웜을 이미지화하는 버스트 무비를 24시간 동안 실행합니다. 먼저 DIC로 20초를 기록한 다음 GFP 형광으로 20초를 기록한 다음 마지막으로 대조군 발현 수준에 대한 mKate2 신호 이미지를 기록합니다.

시각적 데이터 검사의 경우 잘못된 색상 맵을 사용하여 형광 강도의 작은 변화에 대한 가시성을 향상시킵니다. 마지막으로, 표준 절차를 사용하여 칼슘 데이터 분석을 수행합니다.