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생물학
0 조회수 • 3:21 분 • April 30th, 2023
- 시작하려면 어린 성인 벌레를 슬라이드의 새로운 아가로스 패드로 옮깁니다. 그런 다음 12 밀리 몰 레바 미솔 용액을 몇 방울 떨어 뜨려 벌레를 마비시킵니다. 커버슬립으로 벌레를 덮고 몇 분 동안 기다립니다. 회전 디스크 컨포칼 현미경 아래에 슬라이드를 놓고 웜의 가장 바깥쪽 측면에 초점을 맞춥니다.
성충의 표피는 세포 융합 사건으로 인한 다핵 세포융합으로 구성된 얇은 단층 구조입니다. 표피의 정점 표면은 유연한 콜라겐 큐티클을 분비하는 반면, 기저 표면은 기저 층(basal lamina)이라고 하는 얇은 세포 외 기질층으로 덮여 있습니다.
다음으로 표피의 정점 표면을 레이저로 감습니다. 손상된 세포에서 세포질이 누출되어 상처 부위에 거품으로 나타날 수 있습니다.
레이저 방사선 조사는 내부 조직을 손상시키지 않고 큐티클과 표피 세포의 국소적인 파괴를 일으키기 때문에 바늘 상처와 같은 다른 기술에 비해 장점이 있습니다. 예시 프로토콜에서는 예쁜꼬마선충의 레이저 상처 과정을 볼 수 있습니다.
- 선충을 정밀하게 감기 위해 이 프로토콜은 회전 디스크 컨포칼 현미경에 부착된 펨토초 레이저를 사용합니다. 이광자 현미경과 같은 펨토초 레이저를 사용하는 라인 또는 포인트 스캔도 충분해야 합니다.
- 한천 패드에 10명의 청년을 모으는 것으로 시작합니다. 12 밀리 몰 레바 미솔 용액의 2 마이크로 리터 방울로 마비시킵니다. 그런 다음 커버 슬립으로 덮고 마비될 때까지 몇 분 동안 기다립니다.
- 동물이 완전히 마비되는 것이 필수적이다.12밀리몰 레바미솔은 상처 반응에 영향을 미치지 않는다. 그러나, 고정화의 다른 방법도 사용될 수 있다.
- 대물렌즈 전에 측정된 펨토초 레이저 출력이 140밀리와트로 설정되어 있고 레이저 반복률이 80메가헤르츠인지 확인합니다. 이제 회전 디스크 컨포칼 현미경 아래에서 벌레를 찾습니다. 높은 개구수를 가진 100x 대물렌즈를 사용하여 표적 웜의 측면 전방 또는 후방 세포융합 표피에 초점을 맞춥니다.
표피 세포의 정점 표면에 초점을 맞추고, 20 밀리 초로 분리 된 두 개의 200 밀리 초 펄스에 레이저를 비추십시오. 이것은 표피에 상처를 입히기에 충분해야 합니다. 잠시 기다렸다가 거품으로 나타나는 세포질의 국소적 파괴를 관찰하십시오. 형광 마커가 있는 경우 국부적인 표백을 관찰할 수 있습니다.