FITC-덱스트란 공급: 예쁜꼬마선충의 장 투과성을 정량화하는 방법

- 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 장 병원체에 의한 감염의 실험 모델로 사용되며, 부분적으로는 장 장벽을 파괴하여 투과성을 증가시켜 질병을 유발합니다. 관심 박테리아 또는 화합물에 노출된 후 장벽 무결성을 정량화하려면 플레이트에서 지렁이를 씻어내어 수집합니다.

다음으로, 이 벌레를 형광 태그가 있는 고분자량 다당류인 FITC-dextran과 혼합된 열에 의해 죽은 대장 균으로 구성된 라벨이 부착된 식품과 함께 한천 플레이트에 놓습니다.

지렁이가 라벨이 붙은 박테리아를 먹도록 합니다. 장 장벽이 손상되지 않은 기생충은 음식물을 빠르게 배출하는 반면, 장 투과성이 더 높은 기생충은 형광 마커가 장기의 내강을 넘어 침투합니다.

동물을 고치기 위해 벌레를 포름알데히드 용액으로 옮깁니다. 1-2분 후 포름알데히드를 장착 매체로 교체합니다.

마지막으로, 형광 현미경으로 벌레를 이미지화합니다. C. elegans 장 과립은 자가 형광성이므로 배경 신호가 있습니다. 그러나 전반적으로 장 형광이 많을수록 투과성이 더 높다는 것을 나타냅니다.

예시 프로토콜에서는 병원성 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 박테리아에 감염된 기생충의 장 투과성에 대한 생체 분자 DIM을 사용한 처리의 효과를 분석합니다.

- 2 밀리리터의 열 비활성화 대장균과 4 밀리그램의 FITC-덱스트란을 혼합하여 FITC-덱스트란이 보충 된 플레이트를 준비합니다. 20개의 새로운 NGM 한천 플레이트 각각에 혼합물 100마이크로리터를 추가하고 깨끗한 실험실 벤치에서 플레이트를 1시간 동안 건조시킵니다. 48시간 치료 후 S 버퍼로 기생충을 씻어냅니다. FITC-dextran이 보충된 플레이트와 FITC-dextran이 없는 NGM 플레이트로 옮기고 플레이트를 밤새 배양합니다.

다음 날, S Buffer로 지렁이를 씻고 신선한 NGM 한천 플레이트에서 1시간 동안 기어 다니게 합니다. 바닥이 평평한 검은색 96웰 플레이트의 각 웰에 4% 포름알데히드 50마이크로리터를 추가하고 약 50개의 웜을 각 웰로 옮깁니다. 1-2분 후 모든 포름알데히드를 제거하고 각 웰에 100마이크로리터의 장착 매체를 추가합니다.

- 포름알데히드는 독성 화학 물질이므로 주의해서 다루어야 합니다.