생식선 미세주입: 예쁜꼬마선충의 생식세포에 직접 화합물을 전달하는 방법

- 주사를 준비하기 위해 웜 픽을 사용하여 아가로스 패드에 할로카본 오일 트랙을 놓습니다. 기름에 벌레를 넣고 한천 패드에 부드럽게 밀어 고정시킵니다. 기름이 동물을 완전히 덮는지 확인하십시오. 산소가 기생충에 도달하도록 하면서 건조를 방지합니다. 다음으로, 아가로스 패드를 주입 현미경에 놓고 생식선 팔의 말단부를 목표로 바늘을 벌레에 수직으로 배치합니다.

큐티클을 통해 바늘을 부드럽게 밀어 넣고 생식선 팔에 관심 핵산 또는 화합물을 주입합니다. 각 생식선에는 개별 난모세포로 발달할 생식세포 세포융합이 포함되어 있습니다. 원위 생식선에 주입된 물질은 해당 난모세포에 통합되어 다음 세대에 영향을 미칩니다.

웜을 주입한 후 오일을 M9 버퍼로 교체하십시오. 벌레가 움직이기 시작하면 박테리아 먹이가 있는 NGM 한천 플레이트로 옮깁니다. 다음 프로토콜에서는 생식선 미세주입 방법을 사용하여 dpy-10 유전자를 표적화하고 편집하기 위해 Cas9 복합체를 전달합니다.

- 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 예쁜꼬마선충(C. elegans)과 아가로스 패드(agarose pads)를 준비하는 것으로 시작합니다. 아가로스 주사 패드를 놓고 슬립을 해부 내시경에 덮습니다. 웜 픽을 사용하여 패드의 한쪽 가장자리를 따라 할로카본 오일의 작은 트랙을 놓습니다. 그런 다음 오일로 코팅 된 웜 픽을 사용하여 NG 한천 플레이트에서 여러 웜을 들어 올려 오일 트랙으로 들어 올립니다. 속눈썹이나 고양이 수염과 같은 피펫에 가는 털을 부착하고 벌레를 평행하게 놓고 벌레를 아가로스 패드에 부드럽게 밀어 넣습니다. 미세 주입 절차에 익숙해질 때까지 한 번에 하나의 웜만 장착하고 주입하십시오.

제자리에 놓고 패드에 부착하면 웜 픽 끝에서 할로겐 오일 몇 방울을 더 떨어뜨려 웜을 오버레이합니다. 장착된 웜이 있는 커버 슬립을 주입 현미경에 놓습니다. 낮은 배율에서 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 RNP 용액으로 채워진 주사 바늘에 수직으로 웜을 배치합니다.

고배율로 전환하고 생식선 팔에 인접한 바늘을 중기에서 후기 파키텐의 핵 근처 영역에 해당하는 위치로 재배치합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 벌레에 대고 움직여 큐티클을 약간 누릅니다. 그런 다음 한 손으로 현미경 스테이지의 측면을 두드려 큐티클을 통해 바늘을 밀어 넣습니다. 주입 페달이나 버튼을 누르고 생식선 암에 주입 혼합물을 천천히 채우고 바늘을 제거합니다. 다른 생식선 팔에 대해 단계를 반복합니다.

벌레가 주입되면 아가로스 패드의 커버슬립을 제거하고 해부 현미경 아래에 놓습니다. 당겨진 모세관 피펫을 사용하여 M9 버퍼를 웜 위에 피펫으로 웜의 오일을 제거합니다. 이 치료를 수행하여 한천에서 기생충을 풀어줍니다. 10분 후 기생충이 완충액 내에서 몸부림치기 시작하면 당겨진 모세관 피펫을 사용하여 OP50 박테리아가 있는 NG 한천 플레이트로 이동합니다. 벌레가 회복되어 움직일 때까지 2-3시간 동안 접시를 섭씨 20도에 놓습니다. 복구되면 OP50을 사용하여 웜을 NG 한천 플레이트로 개별적으로 옮긴 다음 플레이트를 섭씨 25도의 인큐베이터로 옮깁니다.