배아 기반 화학 독성 스크리닝: 제브라피시 배아 발달에 미치는 영향 평가

- 96웰 플레이트의 각 웰에 E3 배지의 배아 5개를 추가하는 것으로 시작하고 피펫으로 초과 배지를 제거합니다. 오염을 방지하기 위해 각 웰에 카나마이신이 포함된 E3 배지를 추가합니다. 배아가 섭씨 28도에서 자라도록 합니다.

관심 화합물을 DMSO와 같은 적절한 용매로 희석하여 여러 농도 또는 용량을 준비하고 배아 발달에 대한 각 용량의 효과를 테스트합니다. 배아가 원하는 단계에 도달하면 각 원액을 개별 웰에 피펫으로 주입합니다. 접시를 뚜껑으로 덮고 부드럽게 휘저어 내용물을 섞습니다. 웰 플레이트의 배아가 섭씨 28도에서 자라도록 합니다.

배아 발달의 원하는 시기에 웰 플레이트를 적절한 현미경 아래에 놓고 배아의 표현형을 검사합니다. 발달 중인 배아에서 눈 손실, 성장 지연 또는 멜라닌 세포 손실과 같은 표현형을 관찰할 수 있습니다. 다음 프로토콜에서는 전뇌 발달의 소분자 억제제에 대한 화합물 라이브러리를 테스트할 것입니다.

- 소분자 라이브러리는 일반적으로 96웰 소스 플레이트에 공급되며 각 화합물은 DMSO에 10밀리몰 스톡으로 저장됩니다. 배아가 원하는 단계에 도달하기 약 60분 전에 소분자의 분취액을 포함하는 적절한 수의 96웰 플레이트를 해동합니다. 소스 플레이트의 일련 번호 또는 기타 식별 번호를 기록해 두십시오. 플레이트의 응축을 최소화하려면 드리라이트가 포함된 건조 챔버에서 해동하십시오.

멀티웰 플레이트 어댑터가 장착된 탁상용 원심분리기에서 플레이트를 잠시 회전시킵니다. 소스 플레이트에서 알루미늄 밀봉 테이프를 제거합니다. 12채널 피펫을 사용하여 DMSO를 사용하여 소스 플레이트의 화합물을 원하는 농도로 희석합니다. 이 프로토콜에서는 0.5 millimolar 최종 농도를 사용하고 4.75 μlit의 DMSO를 첨가하여 10 millimolar stock plate를 희석합니다.

96웰 플레이트의 배아가 원하는 단계에 도달하면 12채널 피펫을 사용하여 소스 플레이트에서 배아가 포함된 수용 플레이트로 2.5마이크로리터의 화합물을 전달합니다. 현재 배아와 화합물이 들어 있는 플레이트를 뚜껑으로 덮고 배아 플레이트에 소스 플레이트의 식별 번호를 기록합니다. 부드럽게 휘젓면서 플레이트를 섞고 섭씨 28.5도의 인큐베이터에 넣습니다. 사용하지 않은 저분자가 들어 있는 각 소스 플레이트를 알루미늄 밀봉 테이프로 덮고 장기 보관을 위해 섭씨 영하 80도의 냉동고에 넣습니다.

시각적 스크린을 수행하기 전에 특정 히트 기준을 공식화하십시오. 예를 들어, 전뇌 발달의 소분자 억제제에 대한 스크리닝에서, 히트는 전뇌의 손실을 부여하는 화합물일 수 있습니다. 눈이 없다는 것은 전뇌의 손실을 나타내는 쉬운 시각적 지표이며 분석을 위해 형광이 필요하지 않습니다.

원하는 발달 시기에 인큐베이터에서 복합 처리된 배아가 포함된 96웰 플레이트를 제거하고 실체 현미경으로 각 웰을 검사합니다. 전뇌 발달의 소분자 억제제를 스크리닝할 때, 전뇌 발달 억제의 지표로서 눈의 손실이 있는지 28시간 후에 플레이트를 검사합니다. 5개의 배아 중 최소 3개가 규정된 히트 표현형을 나타내는 모든 웰에 대한 플레이트의 정체와 웰 위치를 기록합니다.

96웰 플레이트를 인큐베이터에 다시 놓습니다. 48시간에 눈과 전뇌의 소실을 재확인합니다. 배아에는 전뇌가 없더라도 최소 4일까지 생존할 수 있습니다. 여러 용량에서 화합물의 효과를 재테스트하여 잠재적인 히트를 재확인합니다. 각 용량에 대해 10개의 배아가 48웰 플레이트 형식의 0.5밀리리터의 E3 배지에서 테스트됩니다.

재검사를 위한 화합물 첨가 시기는 원래 스크리닝과 동일해야 합니다. 유도된 표현형이 화합물의 재검사에 대한 용량 의존적 방식으로 재생될 때 히트가 확인됩니다. 마지막으로, chemical library에 있는 small molecules의 데이터베이스에서 hit 화합물을 식별합니다.