표적 간 절제술: 형질전환 제브라피시 유충에서 메트로니다졸을 사용한 간세포 사멸 유도

- 용매인 DMSO가 함유된 달걀수에 메트로니다졸을 녹이고 배아의 색소 형성을 방지하는 페닐티오우레아를 첨가합니다. 적절한 나이의 유충 몇 마리를 치료 및 제어 플레이트로 옮깁니다. 다음으로, 원하는 농도의 메트로니다졸 용액을 시험판에 첨가하고 DMSO를 함유한 계란수를 대조판에 첨가합니다.

두 판의 유충이 섭씨 28도에서 자라도록 합니다. 형질전환 유충은 간세포에서만 니트로환원효소를 생성하며, 이는 메트로니다졸을 세포독성 약물로 전환하여 표적 간세포만 사멸시킵니다. 시술 후 트리트먼트 플레이트에서 메트로니다졸 용액을 제거하고 배아를 난수로 씻습니다.

트리카인을 첨가하여 유충을 마취시키고 간세포의 파괴인 심각한 간세포 절제를 위해 상피 형광 현미경으로 검사합니다. 치료받은 개인이 대조군 개인보다 훨씬 작은 간을 관찰할 수 있습니다. 예시 프로토콜에서는 간 재생을 연구하기 위해 형질전환 제브라피시 유충의 간세포 절제를 위해 메트로니다졸을 사용할 것입니다.

- 최대 100개의 배아를 25ml의 달걀수가 들어 있는 100mm 페트리 접시에 옮기고 접시를 섭씨 28도에 놓습니다. 색소 침착을 억제하려면 수정 후 최대 10시간까지 PTU를 배양액에 첨가하십시오. 수정 후 80시간이 지나면 트리카인으로 유충을 마취하고 상형광 현미경을 사용하여 CFP 양성 유충을 채취하여 비슷한 크기의 간을 가진 동물만 보관합니다.

그런 다음 트리카인 달걀 물을 PTU가 보충된 신선한 달걀 물로 교체하고 CFP 양성 제브라피쉬 유충을 섭씨 28도의 인큐베이터로 되돌립니다. 제브라피시 유충을 MTZ로 처리하려면 먼저 적절한 수의 유충을 두 개의 다른 배양 용기로 나눕니다. 실험용 유충 그룹은 갓 준비된 MTZ 용액에 보관하고 대조군 그룹은 DMSO가 보충된 달걀 물에 보관합니다.

MTZ의 광비활성화를 방지하기 위해 실험 그룹을 알루미늄 호일로 덮고 두 그룹의 제브라피시 유충을 모두 섭씨 28도에서 배양합니다. 절제 기간이 끝나면 플레이트에서 MTZ 용액을 제거하고 MTZ 처리된 용암을 25ml의 달걀 물로 2-3회 세척하고 소용돌이치며 세척할 때마다 달걀 물을 버립니다. 마지막 세척 후, MTZ 처리된 유충의 심장 부종과 죽음을 피하기 위해 이전에 사용된 트리카인 농도의 절반으로 유충을 고정시킵니다. 그런 다음 상형광 현미경의 CFP 필터를 사용하여 MTZ 처리된 용암의 상대적 간 크기를 기반으로 간세포 절제 수준을 평가합니다. 유충의 0%에서 5%를 차지하는 큰 간을 가진 제브라피쉬는 비절제, 중간 크기의 간을 가진 제브라피쉬는 유충의 10%에서 20%를 부분적으로 절제하고, 간이 매우 작은 제브라피쉬는 유충의 80%에서 90%를 차지하는 완전히 절제되는 것을 고려하십시오.