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생물학
0 조회수 • 3:02 분 • April 30th, 2023
- 유전자의 기능을 결정하는 한 가지 방법은 유전자의 발현을 중단하고 그 효과를 관찰하는 것입니다. Morpholino 올리고머는 제브라피쉬의 넉다운 연구에 자주 사용됩니다. 모르폴리노(morpholino)는 약 25개 염기 길이의 합성 DNA와 유사한 분자로, 표적 유전자 발현을 억제합니다.
모르폴리노 치료를 위해 꼬리 지느러미가 부분적으로 절단된 마취된 물고기를 주입 플레이트에 놓고 실체 현미경 아래에 플레이트를 배치합니다. 주사되지 않은 복부 쪽이 대조군 역할을 하는 동안 등쪽에만 주입합니다. 모르폴리노는 표적 염기서열에 따라 두 가지 방식으로 기능할 수 있습니다. 첫째, mRNA의 번역 시작 부위에 결합하고 번역을 차단하여 단백질 합성을 방지합니다.
둘째, pre-mRNA의 인트론-엑손 접합부에 결합하여 적절한 접합을 방해하여 세포에 의해 분해되는 결함 있는 전사체를 초래할 수 있습니다. 나중에 꼬리 지느러미에 외래가 있는지 검사합니다. morpholino 처리 된 영역과 처리되지 않은 영역의 재성장 간의 차이는 표적 단백질이 핀 재생에 중요한 역할을한다는 것을 나타냅니다. 이 프로토콜에서는 꼬리 지느러미 재생 분석의 일부로 morpholinos를 사용합니다.
- 모르폴리노 주사 전날, 웰의 한쪽 끝에 노치가 잘린 2% 아가로스로 주입 플레이트를 만들면 주입 절차를 위해 물고기를 안정화하는 데 도움이 됩니다. 주입 직전에 플루오로세인 태그가 붙은 모르폴리노를 RNAase 및 DNAase free water에 적절한 농도로 희석하고 섭씨 65도의 수조에서 5분 동안 배양합니다. 미리 준비한 주사 바늘을 넣고 팁을 비스듬히 자릅니다.
다음으로 물고기를 마취하고 주입 플레이트에 놓습니다. 여분의 액체를 모두 제거하고 플레이트를 s에 놓습니다.tage 실체 현미경의. 바늘을 뼈 광선 바로 원위 방향으로 향
하게 합니다.각 뼈 광선의 원위부에 있는 재생 조직에 바늘을 부드럽게 삽입하고 배반에 위치할 때까지 원위부로 밉니다. 바늘이 올바르게 국한되면 미세 주입 시스템 지침에 따라 주입당 5나노리터의 모르폴리노 방울을 주입합니다. 주사할 때마다 모르폴리노 용액의 노란색 분파를 볼 수 있으며, 이는 주사를 모세포에 국한시키는 데 도움이 됩니다. 정중선에서 등쪽으로 작업하면서 등쪽 쪽에 뼈 광선당 약 75나노리터의 모르폴리노를 주입하고 복부 쪽은 전기천공만 제어하는 상태로 둡니다.