테일 클립에서 DNA 추출: 제브라피시 유전형 분석에 사용되는 방법

0 조회수2:57 • April 30th, 2023

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- 마취된 성어를 흡수성 종이 더미 위에 올려 놓는 것으로 절차를 시작합니다. 이제 멸균 면도날을 사용하여 꼬리 지느러미를 자르고 물고기를 회복을 위해 담수가 담긴 탱크로 빠르게 옮깁니다. 테일 클립을 용해 완충액이 들어 있는 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 용해 완충액에는 비이온성 세제가 포함되어 있으며, 이는 세포의 원형질막과 핵막을 용해시킵니다. 또한 완충액에는 단백질을 분해하고 DNA가 용해물로 방출될 수 있도록 하는 proteinase K라는 효소가 포함되어 있습니다. 또한 뉴클레아제를 분해하여 뉴클레아제 소화로부터 DNA를 보호합니다.

이제 꼬리 클립이 있는 튜브를 인큐베이터에 밤새 그대로 두어 섭씨 55도에서 지속적인 회전으로 조직을 완전히 분해합니다. 다음으로, 튜브를 섭씨 95도에서 15분 동안 가열하여 단백질 분해 효소 K를 비활성화합니다.튜브를 원심분리하여 소화되지 않은 물질을 펠릿화하고 DNA가 포함된 상등액을 다른 튜브로 옮깁니다. 알코올을 첨가하여 DNA를 침전시키고 다시 원심분리하여 펠릿에 DNA를 수집합니다. 다음 프로토콜에서는 성체 제브라피시의 꼬리 클립과 전체 배아에서 DNA를 분리합니다.

- DNA 준비 당일, 밀리리터당 1밀리그램의 농도로 용해 완충액에 새로운 단백질 분해 효소 K를 추가합니다. 조직은 지느러미 클립을 사용하여 성체 물고기 또는 배아 물고기에서 수집할 수 있습니다.

먼저 트리카인 용액에 물고기를 마취시킵니다. 아가미의 움직임이 느려질 때까지 기다립니다. 그런 다음 물고기를 티슈 더미에 놓고 멸균 면도날로 약 2-3mm 길이의 꼬리 지느러미의 작은 조각을 자릅니다. 회수를 위해 담수가 담긴 라벨이 붙은 수조에 물고기를 빠르게 넣었습니다.

멸균 피펫 팁으로 핀 클립을 집어 100마이크로리터의 DNA 용해 완충액으로 채워진 튜브로 옮깁니다. 동물의 수조와 튜브에 모두 라벨을 붙이십시오. 수집된 모든 조직을 최소 4시간 동안 그리고 섭씨 55도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

배양 후 튜브를 섭씨 95도에서 15분 동안 가열하여 단백질 분해 효소 K를 비활성화합니다. 이 샘플은 즉시 PCR에 사용해야 하지만 섭씨 영하 20도에서 최대 3개월 동안 보관할 수도 있습니다.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026