광시트 현미경 시료 전처리: 장기 이미징을 위한 살아있는 제브라피시 배아 장착

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- 먼저, 용융 아가로스에 탈이온화된 배아에 칼슘을 공급하는 E3 배지를 첨가하여 아가로스를 준비합니다. 다음으로, 배아를 마취하기 위해 MS222를 추가합니다. 아가로스 믹스를 응고에 가까운 섭씨 38도로 냉각합니다. 형광 단백질을 발현하는 몇 가지 dechorionated 배아를 선택하여 agarose mix로 옮깁니다.

다음으로, 플런저를 유리 모세관에 완전히 삽입하고 배아 하나를 추출하여 머리부터 먼저 들어가도록 합니다. 아가로스가 응고되면 테이프를 사용하여 E3 배지가 들어 있는 비커에 모세관을 똑바로 세웁니다. 열린 모세관 바닥은 배아 샘플에 대한 가스 교환을 촉진합니다.

캐필러리를 광시트 형광 현미경의 샘플 홀더에 놓습니다. 레이저는 얇은 광 시트를 형성하여 샘플에 수직으로 배치된 감지 대물렌즈가 단면 이미지를 캡처할 수 있도록 합니다. 예제 프로토콜에서는 발달 중인 눈을 이미지화하기 위해 제브라피시 배아를 장착합니다.

아가로스를 준비하는 것부터 시작합니다. 준비된 1% 저융점 아가로스의 1ml 분취액을 섭씨 70도의 E3 배지에 녹입니다. 약 15분 후, 600마이크로리터의 용융된 아가로스를 1.5밀리리터의 신선한 튜브에 옮기고 250마이크로리터의 E3 배지, 50마이크로리터의 0.4% MS222 및 25마이크로리터의 볼텍스 형광 비드 스톡 용액을 추가합니다.

튜브를 약 섭씨 39도의 가열 블록에 넣어 아가로스가 젤링 지점에 접근하도록 합니다. 다음으로, 테프론 팁 플런저를 1mm 내경의 유리 모세관 바닥까지 밀어 넣습니다. 그중 다섯 가지를 준비한다.

이제 아가로스 혼합물을 간단히 소용돌이친 다음 최소한의 액체로 5개의 배아를 이식합니다. 그런 다음 모세혈관을 삽입하고 머리부터 배아 하나를 흡인합니다.

머리가 꼬리보다 먼저 들어가야 하며 기포가 없어야 합니다. 배아 위에 약 2cm의 아가로스와 그 아래에 약 1cm의 아가로스가 있도록 충분한 용액을 그립니다.

진행하기 전에 각 모세혈관에 하나의 배아를 뽑습니다. 이 단계를 마스터하려면 몇 가지 연습이 필요합니다. 가치가 없는 배아를 사용하여 준비하십시오.

아가로스가 완전히 응고되면 플라스틱으로 비커 벽에 모세혈관을 지지하고 바닥을 용액에 넣어 샘플을 E3 배지에 보관합니다. 이제 샘플 홀더를 조립합니다. 먼저 올바른 크기의 플라스틱 슬리브 두 개를 스템에 서로 마주 대고 삽입합니다.

소매의 슬릿은 바깥쪽을 향해야 합니다. 그런 다음 클램프 나사를 부착하고 반대쪽에 검은색 띠가 보일 때까지 홀더를 통해 모세관을 삽입합니다. 플런저를 만지지 마십시오.

그런 다음 cl을 조입니다.amp 나사. 다음으로, 모세 혈관에서 아가로스를 1cm 정도 밀어내고 잘라냅니다. 그런 다음 스템을 샘플 홀더 디스크에 삽입합니다.

s를 로드하기 전에ample 디스크, stage가 제어 소프트웨어의 가장 높은 위치에 있습니다. 그런 다음 가이드 레일을 사용하여 홀더를 미끄러지듯 움직이고 샘플을 현미경으로 내려갑니다. 이제 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 선택한 샘플을 이미지화합니다.

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Last updated: 25 July 2026