Layered Agar Mounting: 도립 현미경을 사용한 장기 이미징을 위한 살아있는 제브라피시 배아 준비

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생물학

0 조회수 • 3:27 분 • April 30th, 2023

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- E3 배지의 배아가 들어 있는 페트리 접시로 시작합니다. 배아를 마취하기 위해 트리카인을 첨가하고 색소 형성을 억제하기 위해 PTU 용액인 페닐티오리아를 첨가합니다. 해부 현미경의 도움으로 배아를 탈포합니다.

유리 피펫을 사용하여 dechorionated 배아 중 하나를 중앙에 얕은 유리 바닥이 있는 작은 페트리 접시로 옮기고 여분의 배지를 제거합니다. 다음으로, 배아 왜곡과 운동성을 최소화하기 위해 최적의 농도로 아가로스 용액을 마이크로분리 튜브에 넣고 가열합니다. 열로 인한 배아 손상을 방지하기 위해 온도를 섭씨 30도로 낮추십시오.

배아 위에 아가로스의 첫 번째 층을 붓고 얕은 우물을 완전히 채웁니다. 우물 위에 다른 덮개 유리를 놓고 그 위에 1% 아가로스를 추가합니다. 두 번째 레이어는 커버 유리를 제자리에 고정합니다.

아가로스가 응고되면 트리카인이 함유된 E3 배지로 페트리 접시를 채웁니다. 이것은 세 번째 층이며 아가로스와 배아를 수분으로 유지합니다. 다음 프로토콜에서는 확장된 타임 랩스 이미징을 위해 제브라피시 배아의 층상 한천 장착을 수행합니다.

- 장착 직전에 아가로 스 용액을 섭씨 65도까지 가열 한 다음 배아가 열에 해를 입지 않도록 섭씨 30도 정도로 식히고 아가로 스 용액에 트리카인을 첨가합니다. 숫자 0으로 덮인 유리 바닥이 있는 35mm 유리 바닥 접시를 사용하십시오. 유리 피펫 또는 마이크로 피펫을 사용하여 측면의 한쪽이 접시 바닥을 향하도록 배아를 부드럽게 놓습니다. 그런 다음 마이크로피펫으로 남아 있는 E3를 조심스럽게 제거합니다.

배아를 덮기 위해 접시 바닥에 부착된 덮개 유리에 의해 생성된 작은 우물에 첫 번째 아가로스 용액을 추가하고 아가로스가 작은 우물을 덮지만 넘치지 않도록 합니다. 두 개의 커버 안경 사이에 배아가 있는 좁은 아가로스로 채워진 공간을 만들기 위해 커버 유리로 작은 우물을 덮습니다. 접시 바닥 전체에 커버 유리 위에 1% 아가로스 용액 층을 놓으면 커버 유리가 굳어질 때 제자리에 유지됩니다. 그런 다음 접시의 나머지 부분을 0.02% 트리카인이 함유된 E3로 채워 시스템을 수분으로 유지합니다. 레이어 1에 대한 최적의 아가로스 농도를 식별하려면 증가하는 농도의 아가로스를 배아에 장착하고 타임랩스 이미징을 수행하여 배아 왜곡 및 운동성을 최소화하는 농도를 식별한 다음 결과를 기반으로 더 미세한 농도 범위를 테스트합니다.

- 이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 레이어 1에 대한 아가로스의 최적 농도를 식별하는 것입니다. 최적의 농도를 찾기 위해 0.030%, 0.032% 등과 같은 다양한 나노 농도의 아가로스를 테스트합니다.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026