이광자 레이저 축삭 절개술: 제브라피시 배아에서 축삭을 손상시키고 축삭 회복을 관찰하는 방법
0 조회수 • 3:24 분 • April 30th, 2023
- 관심 배아를 페닐 티오우레아(phenyl thiourea), PTU, 수정 후 24시간부터 시작되는 색소 형성을 억제하는 링거 용액(Ringer's solution)에 넣습니다. 이것은 이 절차에 필요한 발달 중인 해부학적 구조를 더 잘 보이게 합니다. 트리카인 마취된 배아를 이미징 챔버로 이식합니다. 그 위에 유리 슬라이드를 놓고 현미경으로 봅니다. GFP를 유전자 변형으로 발현하기 때문에 488 나노미터 레이저 아래에서 볼 수 있는 손상된 축삭에 초점을 맞춥니다.
사이트의 이전 이미지를 가져옵니다. 다음으로, GFP가 적색 형광을 발하도록 하는 910나노미터 레이저로 축삭을 봅니다. 이 레이저의 강도를 높여 주변 조직에 영향을 주지 않고 대상 부위를 손상시킵니다. 이 과정을 축삭절개술이라고 합니다. 흩어진 파편으로 나타나는 축삭 절개술을 확인하기 위해 첫 번째 레이저로 새 이미지를 촬영합니다. 다음 프로토콜에서는 이광자 레이저를 사용하여 제브라피시 배아에서 말초 감각 축삭돌기의 축삭 절개술을 수행합니다.
- 실험실에서 맞춤형 이광자 내시경을 사용할 수 없는 경우 Zeiss 510 컨포칼 이광자 현미경을 사용하여 축삭을 절단할 수도 있습니다. 먼저 장착된 배아를 무대에 배치하고 25x 물 대물렌즈를 사용하여 초점을 맞춥니다. 그런 다음 멀티트랙 설정에서 두 개의 광자 및 아르곤 레이저를 켜서 하나에서 다른 것으로 전환할 수 있습니다.
GFP를 감지하기 위해 두 레이저 모두 사용되지만, 두 광자 방출은 두 레이저를 구별하기 위해 빨간색으로, 아르곤 레이저 방출은 녹색으로 시각화합니다. 아르곤 레이저를 사용하여 손상시킬 축삭을 식별합니다. Z 설정에서 첫 번째 및 마지막 광학 섹션을 표시하고, 컨포칼 이미지를 촬영하고, Z 스택의 최대 프로젝션을 만듭니다.
아르곤 레이저를 끄고 두 광자 레이저를 켭니다. 약 9% 투과의 강도로 스캔하여 축삭이 여전히 초점이 맞는지 확인합니다. 자르기 도구를 사용할 수 있도록 중지 버튼을 클릭합니다. 자르기를 사용하여 관심 영역을 확대합니다. 일반적으로 약 70배로 확대합니다. 다칠 축삭 부위를 선택하고 이 부위에 초점을 맞춥니다. 확대/축소는 모드 탭에서 확인할 수 있습니다.
그런 다음 채널 탭에서 두 광자의 강도를 약 9% 투과에서 15% 및 30% 투과로 변경합니다. 새 설정을 활성화하려면 빠른 XY 버튼을 클릭한 다음 과도한 손상을 방지하기 위해 빠르게 중지를 클릭하십시오. 절차가 효과가 있었다면 축삭돌기는 흩어진 파편으로 보아야 합니다. 마지막으로, 축삭돌기가 실제로 손상되었는지 확인하려면 488 나노미터 아르곤 레이저로 다시 전환하십시오. 또 다른 컨포칼 이미지를 가져와서 Z 스택의 최대 투영을 만듭니다.
개요
본 논문은 이광자 레이저를 사용하여 제브라피쉬 배아의 말초 감각 축삭에 축삭절단술(axotomy)을 수행하는 프로토콜을 설명합니다. 이 절차는 색소 형성을 억제함으로써 발달 중인 해부학적 구조의 가시성을 높여줍니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 발생생물학
- 이미징 기술
배경
- 축삭절단술은 축삭 손상 및 재생을 연구하는 데 사용되는 방법입니다.
- 제브라피시 배아는 발달 연구를 위한 가치 있는 모델입니다.
- 이광자 현미경을 통해 축삭을 정밀하게 타겟팅할 수 있습니다.
- GFP 발현은 이미징 과정 중 축삭을 시각화하는 데 도움이 됩니다.
연구 목적
- 제브라피시 배아에서의 축삭절단(axotomy) 기술을 시연합니다.
- 해당 분야 연구자들에게 상세한 프로토콜을 제공합니다.
- 신경과학 연구에서 이광자 레이저 기술의 활용을 강조합니다.
사용된 방법
- 색소 형성을 억제하기 위해 배아를 phenyl thiourea로 처리합니다.
- 이미징 및 축삭 손상을 위해 이광자 및 아르곤 레이저를 사용합니다.
- 축삭 손상을 확인하기 위해 공초점 이미징을 수행합니다.
- 주변 조직의 손상을 최소화하기 위해 레이저의 강도 설정을 조정합니다.
주요 결과
- 축삭 절단이 성공적으로 이루어지면 흩어진 파편들이 관찰됩니다.
- 시술 전후의 이미지를 통해 손상 부위를 확인합니다.
- 본 프로토콜은 맞춤형 현미경 설정과 표준 현미경 설정 모두에서 재현 가능합니다.
- 레이저 방출 광원을 시각적으로 구분함으로써 정밀한 타겟팅이 가능합니다.
결론
- 축삭 절단술은 제브라피쉬의 축삭 손상을 연구하는 데 효과적입니다.
- 이광자 현미경은 신경과학 연구에 매우 유용한 도구입니다.
- 본 프로토콜은 다양한 이미징 시스템에 맞게 조정하여 적용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업계 관련 주요 요약
이 방법은 살아있는 척추동물 모델에서 정밀한 축삭 손상을 가능하게 하여, 신경 퇴행 및 회복 경로에 관한 기전 연구를 지원합니다. 또한 초기 발굴 단계에서 신경 보호 화합물과 재생 표현형을 평가할 수 있는 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다. 이 접근 방식은 유전적 또는 약리학적 섭동을 기능적 축삭 결과와 연결함으로써 표적 검증을 강화합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 질병 관련 척추동물 시스템에서 축삭의 무결성 및 재생 메커니즘의 조사를 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 신경 보호 또는 재생 촉진 후보 물질의 표적 결합 능력을 평가할 수 있는 정량 가능한 손상 모델을 제공합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 고함량 이미지 기반 스크리닝에 적합한 표준화된 축삭 손상 판독 결과를 생성합니다.
- 운용적 가치: 제어된 레이저 매개변수와 GFP 기반 축삭 시각화를 통해 분석의 재현성을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 분자 표적과 축삭 재생 표현형을 연결함으로써 메커니즘적 위험 제거를 용이하게 합니다.
- 운영적 가치: 동일 개체 내에서 회복 과정을 종단적으로 추적할 수 있게 하여, 전임상 효능 평가의 변동성을 줄여줍니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 초기 발견 단계에 적합하며, 축삭 회복력의 표적 조절을 평가하여 전임상 투자 전의 리드 물질 확인 결정을 위한 정보를 제공합니다.
- 발견 생물학: 축삭 변성과 재생에 영향을 미치는 유전자 또는 화합물의 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 화합물 라이브러리 프로파일링을 위해 정량적이고 영상 기반인 축삭 무결성 지표를 제공합니다.
- 분석: 공초점 현미경 및 형광 강도를 통해 손상 전후의 축삭 구조 비교를 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 제브라피쉬 기반 질병 모델과 연계하여 축삭 재생 기전의 보존성을 평가합니다.
- 기업 재사용: 여러 신경치료 프로그램에 적용 가능한 재사용 가능한 축삭 손상 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 기전과 축삭 표현형을 연결함으로써 표적 검증의 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
- 운영적 가치: 축삭 손상 유도 과정을 표준화하여 팀 및 사이트 간의 재현성을 높입니다.
- 전략적 가치: 조기 표현형 위험 제거를 통해 신경퇴행 프로그램의 생물학적 위험을 감소시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 척추동물 모델의 축삭 회복 데이터를 기반으로 한 go/no-go 결정 과정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 레이저 현미경 및 제브라피쉬 배아 핸들링 숙련도가 필요합니다.
- GFP 발현 라인을 이용한 이광자 레이저 주사 공초점 현미경 사용이 필수적입니다.
- 레이저 강도와 노출 파라미터를 표준화하여 실험 전반에 걸쳐 일관된 손상을 유도해야 합니다.
- 서로 다른 축삭 유형에 적응시키려면 형질전환 라인 선택 및 이미징 깊이 조정이 필요할 수 있습니다.
- 색소성 배아에서 최적의 시각화를 위해 PTU를 통한 색소 억제가 필요합니다.
바이오 제약 FAQ
전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비
관련 동영상
0 조회수
살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징
관련 동영상
0 조회수
드로소필라 멜라노가스터에서 축사 사망 시축과 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가
관련 동영상
0 조회수
라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상
관련 동영상
0 조회수
Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상
관련 동영상
0 조회수
Two-Photon Laser-Induced Neural Injury: A Method to Observation Axon Degeneration and Regeneration in Drosophila larvae (이광자 레이저 유도 신경 손상: 초파리 유충에서 축삭돌기 퇴행 및 재생을 관찰하는 방법)
관련 동영상
0 조회수
컨포칼 현미경을 사용한 제브라피시의 레이저 절제 신경마스트 세포의 회복 모니터링
관련 동영상
0 조회수
컨포칼 현미경을 사용한 제브라피시 유충의 선택적 단일 뉴런 레이저 절제
관련 동영상
0 조회수
제브라피시 라라바(Larava)에서 이광자 현미경을 사용한 표적 신경 세포 절제
관련 동영상
0 조회수
모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상
관련 동영상
0 조회수
마지막 업데이트: 29 8월 2026