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- 관심 배아를 페닐 티오우레아(phenyl thiourea), PTU, 수정 후 24시간부터 시작되는 색소 형성을 억제하는 링거 용액(Ringer's solution)에 넣습니다. 이것은 이 절차에 필요한 발달 중인 해부학적 구조를 더 잘 보이게 합니다. 트리카인 마취된 배아를 이미징 챔버로 이식합니다. 그 위에 유리 슬라이드를 놓고 현미경으로 봅니다. GFP를 유전자 변형으로 발현하기 때문에 488 나노미터 레이저 아래에서 볼 수 있는 손상된 축삭에 초점을 맞춥니다.
사이트의 이전 이미지를 가져옵니다. 다음으로, GFP가 적색 형광을 발하도록 하는 910나노미터 레이저로 축삭을 봅니다. 이 레이저의 강도를 높여 주변 조직에 영향을 주지 않고 대상 부위를 손상시킵니다. 이 과정을 축삭절개술이라고 합니다. 흩어진 파편으로 나타나는 축삭 절개술을 확인하기 위해 첫 번째 레이저로 새 이미지를 촬영합니다. 다음 프로토콜에서는 이광자 레이저를 사용하여 제브라피시 배아에서 말초 감각 축삭돌기의 축삭 절개술을 수행합니다.
- 실험실에서 맞춤형 이광자 내시경을 사용할 수 없는 경우 Zeiss 510 컨포칼 이광자 현미경을 사용하여 축삭을 절단할 수도 있습니다. 먼저 장착된 배아를 무대에 배치하고 25x 물 대물렌즈를 사용하여 초점을 맞춥니다. 그런 다음 멀티트랙 설정에서 두 개의 광자 및 아르곤 레이저를 켜서 하나에서 다른 것으로 전환할 수 있습니다.
GFP를 감지하기 위해 두 레이저 모두 사용되지만, 두 광자 방출은 두 레이저를 구별하기 위해 빨간색으로, 아르곤 레이저 방출은 녹색으로 시각화합니다. 아르곤 레이저를 사용하여 손상시킬 축삭을 식별합니다. Z 설정에서 첫 번째 및 마지막 광학 섹션을 표시하고, 컨포칼 이미지를 촬영하고, Z 스택의 최대 프로젝션을 만듭니다.
아르곤 레이저를 끄고 두 광자 레이저를 켭니다. 약 9% 투과의 강도로 스캔하여 축삭이 여전히 초점이 맞는지 확인합니다. 자르기 도구를 사용할 수 있도록 중지 버튼을 클릭합니다. 자르기를 사용하여 관심 영역을 확대합니다. 일반적으로 약 70배로 확대합니다. 다칠 축삭 부위를 선택하고 이 부위에 초점을 맞춥니다. 확대/축소는 모드 탭에서 확인할 수 있습니다.
그런 다음 채널 탭에서 두 광자의 강도를 약 9% 투과에서 15% 및 30% 투과로 변경합니다. 새 설정을 활성화하려면 빠른 XY 버튼을 클릭한 다음 과도한 손상을 방지하기 위해 빠르게 중지를 클릭하십시오. 절차가 효과가 있었다면 축삭돌기는 흩어진 파편으로 보아야 합니다. 마지막으로, 축삭돌기가 실제로 손상되었는지 확인하려면 488 나노미터 아르곤 레이저로 다시 전환하십시오. 또 다른 컨포칼 이미지를 가져와서 Z 스택의 최대 투영을 만듭니다.
