이광자 레이저 축삭 절개술: 제브라피시 배아에서 축삭을 손상시키고 축삭 회복을 관찰하는 방법

- 관심 배아를 페닐 티오우레아(phenyl thiourea), PTU, 수정 후 24시간부터 시작되는 색소 형성을 억제하는 링거 용액(Ringer's solution)에 넣습니다. 이것은 이 절차에 필요한 발달 중인 해부학적 구조를 더 잘 보이게 합니다. 트리카인 마취된 배아를 이미징 챔버로 이식합니다. 그 위에 유리 슬라이드를 놓고 현미경으로 봅니다. GFP를 유전자 변형으로 발현하기 때문에 488 나노미터 레이저 아래에서 볼 수 있는 손상된 축삭에 초점을 맞춥니다.

사이트의 이전 이미지를 가져옵니다. 다음으로, GFP가 적색 형광을 발하도록 하는 910나노미터 레이저로 축삭을 봅니다. 이 레이저의 강도를 높여 주변 조직에 영향을 주지 않고 대상 부위를 손상시킵니다. 이 과정을 축삭절개술이라고 합니다. 흩어진 파편으로 나타나는 축삭 절개술을 확인하기 위해 첫 번째 레이저로 새 이미지를 촬영합니다. 다음 프로토콜에서는 이광자 레이저를 사용하여 제브라피시 배아에서 말초 감각 축삭돌기의 축삭 절개술을 수행합니다.

- 실험실에서 맞춤형 이광자 내시경을 사용할 수 없는 경우 Zeiss 510 컨포칼 이광자 현미경을 사용하여 축삭을 절단할 수도 있습니다. 먼저 장착된 배아를 무대에 배치하고 25x 물 대물렌즈를 사용하여 초점을 맞춥니다. 그런 다음 멀티트랙 설정에서 두 개의 광자 및 아르곤 레이저를 켜서 하나에서 다른 것으로 전환할 수 있습니다.

GFP를 감지하기 위해 두 레이저 모두 사용되지만, 두 광자 방출은 두 레이저를 구별하기 위해 빨간색으로, 아르곤 레이저 방출은 녹색으로 시각화합니다. 아르곤 레이저를 사용하여 손상시킬 축삭을 식별합니다. Z 설정에서 첫 번째 및 마지막 광학 섹션을 표시하고, 컨포칼 이미지를 촬영하고, Z 스택의 최대 프로젝션을 만듭니다.

아르곤 레이저를 끄고 두 광자 레이저를 켭니다. 약 9% 투과의 강도로 스캔하여 축삭이 여전히 초점이 맞는지 확인합니다. 자르기 도구를 사용할 수 있도록 중지 버튼을 클릭합니다. 자르기를 사용하여 관심 영역을 확대합니다. 일반적으로 약 70배로 확대합니다. 다칠 축삭 부위를 선택하고 이 부위에 초점을 맞춥니다. 확대/축소는 모드 탭에서 확인할 수 있습니다.

그런 다음 채널 탭에서 두 광자의 강도를 약 9% 투과에서 15% 및 30% 투과로 변경합니다. 새 설정을 활성화하려면 빠른 XY 버튼을 클릭한 다음 과도한 손상을 방지하기 위해 빠르게 중지를 클릭하십시