제브라피시 광유전학: 유충 행동 반응을 연구하기 위해 유전자 변형 체성 감각 뉴런 활성화

- 제브라피시 유충에서 시각적 자극은 체성 감각 뉴런을 활성화하고 탈출 반응을 유발할 수 있습니다. 유충에서 발견되는 뉴런에는 삼차 뉴런과 로혼 수염 뉴런의 두 가지 유형이 있습니다. 우리는 형질전환 빛에 민감한 이온 채널을 발현하도록 뉴런을 변형하여 이러한 뉴런의 활동을 조작할 수 있습니다. 이 접근 방식을 광유전학이라고 합니다.

이 기술을 수행하려면 등쪽이 위를 향하도록 형질전환 유충을 아가로스 젤에 장착하고 해부 현미경 아래에 놓습니다. 면도날을 사용하여 노른자와 꼬리 주변에서 쐐기 모양의 아가로스 부분을 분리합니다. 이 부분을 달걀 물로 채웁니다. 유충의 몸통과 꼬리에서 아가로스를 당겨 빼냅니다.

광케이블의 끝을 로혼-비어드(Rohon-Beard) 뉴런의 세포체가 있는 몸통 근처에 놓습니다. 블루 레이저 광의 펄스를 전달합니다. 청색광에 노출되면 뉴런 막의 형질전환 빛에 민감한 이온 채널이 열려 이온이 들어갈 수 있게 되어 탈출 반응을 유도하는 활동 전위가 트리거됩니다. 고속 카메라를 사용하여 유충의 행동을 기록하십시오.

예제 프로토콜에서는 유충을 장착하여 Rohon-Beard 뉴런을 활성화하여 채널로돕신 변이체를 발현하고 행동 반응을 관찰합니다.

- 이중 증류수에 1.5 % 저융점 아가로 로즈를 만들어 응고를 방지하기 위해 섭씨 42도의 열 블록에 보관하십시오. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 사전 선별 유충 중 하나를 가능한 한 적은 파란색 배아 물이 함유된 1.5% 저융점 아가로스 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 아가로스 한 방울에 담긴 유충을 작은 페트리 접시에 옮깁니다.

해부 현미경으로 유충의 등쪽을 위로 향하게 놓습니다. 아가로스가 굳어지면 얇은 면도날을 사용하여 유충의 양쪽에서 아가로스를 잘라냅니다. 아가로스 주변 지역을 배아 푸른 물로 채웁니다.

다음으로, 노른자의 양쪽을 대각선으로 두 개 자르고 유충에 흠집이 나지 않도록 주의하십시오. 그 후, 아가로즈를 유충의 몸통과 꼬리에서 떼어냅니다.

이제 고속 카메라를 해부 스코프에 장착하고 카메라를 컴퓨터에 연결합니다. 그런 다음 컴퓨터와 고속 카메라를 켭니다. 비디오 이미징 소프트웨어를 열고 카메라 설정을 조정합니다. 다음으로 광 케이블, 레이저 및 자극기를 함께 연결합니다. 그런 다음 자극기를 켜고 최대 5볼트와 5밀리초의 펄스 지속 시간으로 설정합니다. 그런 다음 레이저를 켭니다.

다음으로, 형광 해부 현미경을 사용하여 ChEF-tdTomato