배아 미세주입: 제브라피시 노른자에 화합물을 전달하는 기술

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생물학

0 조회수 • 3:58 분 • April 30th, 2023

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- 주사 하루 전에 두 마리의 암컷과 두 마리의 수컷 물고기를 나누어 번식 탱크에 넣습니다. 다음 날 아침, 칸막이를 제거하고 수조 바닥에서 알이 관찰 될 때까지 물고기가 번식하도록하십시오. 달걀을 모아 살균제인 메틸렌 블루가 함유된 E3 배지로 씻습니다. 현미경으로 난자를 관찰하고 수정되지 않은 난자를 제거합니다. 수정되지 않은 난자는 투명한 난황 막을 가지고 있는 반면 수정란은 어두운 난황 막을 가지고 있습니다.

10개의 배아를 주입되지 않은 대조군으로 별도의 페트리 접시에 보관하십시오. 전사 피펫을 사용하여 실온에서 배아를 미세주입판의 홈통에 정렬하고 현미경 아래에 놓습니다. 마이크로 주입 바늘을 융모막을 통해 노른자로 부드럽게 밀어 넣고 페놀 레드와 같은 마커가 포함된 관심 화합물을 천천히 주입합니다. 세포질 흐름은 화합물이 배아 세포로 확산되도록 합니다.

주입 후 섭씨 28도에서 메틸렌 블루가 함유된 E3 배지에서 배아를 성장시킵니다. 배아의 건강 상태를 계속 확인하십시오. 죽거나 비정상적으로 발달하는 배아를 제거하고 배지를 매일 교체하십시오. 다음 프로토콜에서는 마이크로주입을 사용하여 리보핵단백질 또는 RNP 복합체를 제브라피시 배아에 전달합니다.

- 먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 주사를 수행하기 전날 밤에 제브라피시 피험자가 번식할 수 있도록 준비합니다. 그런 다음 Cas9 단백질과 sgRNA를 2:1 비율로 결합합니다. Cas9 및 sgRNA가 리보핵단백질 복합체를 형성하는 동안 실온에서 용액을 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 충분한 RNase 자유수에 0.5마이크로리터의 2.5% 페놀 레드 용액을 추가하여 최종 부피 5마이크로리터를 얻습니다.

주사 바늘을 준비하려면 마이크로피펫 풀러를 사용하여 1mm 유리 모세관을 당깁니다. 그런 다음 결과 생성된 유리 바늘의 끝을 면도날로 잘라 각진 구멍을 얻습니다. 마이크로인젝터에 부착된 마이크로매니퓰레이터에 바늘을 넣습니다. 광학 현미경을 사용하여 바늘이 페트리 접시에 1나노리터의 용액을 일관되게 주입할 때까지 주입 압력을 조정합니다.

- 배아 미세주입을 시행하기 전에 염료만 함유한 용액을 사용하여 주삿바늘 준비 및 대조 배아를 주입하는 연습을 하고 발달 후 24시간 후의 생존을 기록합니다. 주사하지 않은 대조군에 비해 90% 이상의 생존율을 얻을 수 있어야 합니다.

- 다음으로, 10-15개의 배아를 대조군 집단으로 선택하고 라벨이 붙은 별도의 페트리 접시에 넣습니다. 전사 피펫을 사용하여 나머지 배아를 실온 주입판에 조심스럽게 정렬합니다. 해부 현미경으로 1나노리터의 용액을 각 배아의 난황낭에 주입합니다. 그런 다음 주입된 배아를 라벨이 부착된 페트리 접시에 다시 넣고 메틸렌 블루가 함유된 1X E3 배지로 덮습니다. 주입된 배아를 섭씨 28도의 인큐베이터에 24시간 동안 놓습니다. 그런 다음 주입된 배아를 검사하여 죽거나 비정상적으로 발달하는 개체를 제거합니다.

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