Name: Immunoelectron 현미경을위한 마우스 뇌 조직의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-20T17:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 배우세요 마우스 뇌 조직을 면역전자현미경용으로 준비하는 방법을. 경심장 관류 고정, 뇌 절단, 면역효소 염색을 포함한 이 프로토콜은 중추신경계 단백질 분포를 고해상도로 시각화하여 신경과학 연구에 필수적인 세포 구조 이해를 제공합니다.

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우리는 기술 지원을 위해 로체스터 의료 센터의 대학의 전자 현미경 연구의 핵심 시설에 연동 펌프와 vibratome의 사용뿐만 아니라, 카렌 L. 벤틀리와 게일 슈나이더에 대한 Shao - 명나라 루 해리스 A. Gelbard 감사합니다. 이 작품은 NIH (EY019277), 화이트홀 재단, 버로우즈 웰컴 기금과 AKM에 알프레드 P. 슬로안 재단의 기금에 의해 투자되었다. M.-È.T. 퐁 드 라 공들인 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ) 박사 교육 수상에 의해 후원됩니다.

1. 동물 재관류 <ol><li> 재관류 전날에 준비 : - 인산염 버퍼 2 패 (PB, 100 MM, 산도 7.4) 및 나트륨 1 L 인산염 버퍼 호수 (PBS를, 0.9 % 50 MM PB에 NaCl, 산도 7.4)을 두 번 증류수 인치 4 PB의 PBS와 1L ° C.를 저장 이들은 재관류 및 사전 삽입의 immunocytochemistry에 사용됩니다. - 6 생쥐의 재관류를 가능하게 4.0 %의 paraformaldehyde의 1L (PFA, 산도 7.4) 정착액 솔루션. 그 목적을 위해, 가열 퓸 후드 아래에 PB 1 패 있습니다. 세분화된 paraformaldehyde (PFA)의 40g의 무게를하고 60 ° C.에 도달하면 PB 솔루션에 따르다 솔루션은 4 실온 (RT)과 저장하는 시원한 PFA 완전히 용해, ° C.으로 명확하면 </li><li> 재관류의 날, 퓸 후드 아래의 PB에 3.5 %의 acrolein 솔루션 500 ML을 준비합니다. 그런 다음, 3.5 % acrolein와 필터 용지를 사용하여 4.0 % PFA 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 마우스 마취 들어, 27 게이지 ½ "바늘과 복막에 (80 MG / kg) 나트륨은 pentobarbital 주입. </li><li> 재관류 동안, PBS 50 ML은 acrolein의 75 ML 및 PFA 150 ML은 순차적으로 마우스 순환에 전달합니다. 연동 펌프를 설정하려면, PBS로 튜브를 기입 한쪽 끝에 23 게이지 어 "나비 바늘을 수정. 재관류 솔루션 (PBS, acrolein 또는 PFA)에 관의 다른 쪽 끝을 담가. 연동의 속도를 설정 20-25 ML / 청소년 및 성인 쥐에 대한 분에 펌프. 재관류 동안 조심스럽게 튜브의 성형 공기의 거품을하지 마십시오. </li><li> anaesthetized 마우스가 더 이상 같은 꼬리 핀치로 통증 자극에 반응하지 않을 때까지 계속 진행하기 전에, 잠깐 만요. 절개 트레이에 동물을 배치하고 테이프를 사용하여 발 수정. 족집게와 가위로, 피부와 마음을 노출 흉강을 엽니다. 뇌 국소 빈혈을 최소화하려면, 재관류가 빠르게 시작되어야합니다. 작은 가위로 오른쪽 아트리움을 열고 잘라 연동 펌프를 시작합니다. 핀셋으로 마음을 잡고 있지만, 좌심실의 꼭대기에 나비 바늘을 삽입합니다. </li><li> 솔루션을 변경하면, 연동 펌프를 중지 해결책이 하나에서 다른 튜브를 전송하고, 즉시 펌프를 다시 시작합니다. </li><li> PFA 150 ML이 통과되면, 연동 펌프를 중지합니다. 작은 가위를 사용하여, 머리를 잘라 껍질을 열고 눈 사이 두개골을 깰. 두뇌가 쉽게 제거할 수있을 때까지 머리 작은 조각에서 신중하게 칩을 작은 핀셋을 사용합니다. 4에서 2 시간 동안 머리를 포스트 수정 ° PFA에서 C. PBS로 3 회 10 분 씻으십시오. </li><li> 즉시 vibratome를 사용하여 얼음 냉각 PBS에서 가로의 두뇌 (50 μm의 두께 부분)을 잘라. 좋은 브러시로 PBS를 포함하는 유리관에 immunocytochemistry에 대해 선택한 섹션을 전송합니다. 몇 년 최대 cryoprotectant에서 -20 ° C (30 % 에틸렌 글리콜과 PBS에 30 % 글리세롤)의 나머지 부분을 저장합니다. </li></ol> 2. 사전 퍼가기의 immunocytochemistry <ol><li> immunocytochemistry 들어, 섹션은 자유롭게 유리 튜브에 떠있 처리됩니다. 절차 전반에 걸쳐, 하나주의 깊게 섹션 밖으로 건조시키는 않도록해야합니다. </li><li> 첫째, 전송 피펫을 사용하여 PBS를 제거하고 즉시 RT 30 분 PBS에 0.​​1 %의 나트륨 borohydride의 새로운 솔루션으로 대체합니다. </li><li> 모든 거품을 제거, PBS 3 회 십분와 섹션을 씻어하고, 0.5 젤라틴 %와 보조 항체가 생성된있는 동물의 5 % 정상 혈청 (정상 염소 혈청에를 포함하는 PBS의 차단 솔루션 RT에서 2 시간 동안 부화 Iba1 - immunostaining의 현재 예). </li><li> 솔루션을 차단의 기본 항체를 48 시간 동안 부화. Iba1 - immunostaining 들어, 토끼 방지 Iba1 항체 (1:1000)를 사용합니다. </li><li> PBS 3 회 십분와 섹션을 씻어 RT에서 2 시간 동안 솔루션을 차단에 비오틴을 복합 이차 항체 (1:1000)에 품어. Iba1 - immunostaining 들어, 염소 방지 토끼 IgGs를 사용합니다. </li><li> PBS 3 회 십분와 섹션을 씻어 RT에서 1 시간 동안 솔루션을 차단에 streptavidin - 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (1:1000)에 품어. </li><li> PBS 십분와 트리스 / HCL - 버퍼 식염수에 섹션 린스 (TBS, 50 MM, 산도 7.4)은 2 번 10 분 거리에 있습니다. 레이블을 표시하려면, 0.05 %의 DAB와 TBS에서 0.01 %의 과산화수소 (신선한 솔루션)와 섹션을 품어. 얼룩이 (그림 1 예 참조) 어두운 갈색 때, TBS에서 rinsing하여 반응을 중지합니다. 어떤 경우에는 5 분 최대 후 반응을 종료합니다. TBS 십분과 PB 2 배 십분와 섹션을 씻어. </li></ol> 3. 전자 현미경에 대한 처리 <ol><li> 좋은 브러쉬를 사용하여 multiwell 문화 판에서 PB로 섹션을 전송합니다. 발연 후드 아래의 PB에 1 % 오스뮴의 tetroxide 솔루션을 준비합니다. 문화 판의 우물에서 PB를 제거하고 좋은 브러시로 평면 섹션을 확산. RT 30 분 1 % 오스뮴에 즉시 몰두 섹션. </li><li> 유리 튜브에 섹션을 전송, PB 3 회 십분와 린스, 그리고 에탄올의 농도 상승으로 2 분 immersions 통해 탈수 : 2 곱하기 35 %, 1 회 50 % 각각 70 %, 80 %, 90 %, 및 95 %, 3 회 프로필렌 산화물 다음 백퍼센트 3 회. </li><li> Durcupan 수지를 준비하려면, 색상 균일 될 때까지, 구성 요소 B의 20g, 구성 요소 C의 0.6 g, 그리고 일회용 비이커에 구성 요소 D의 0.4 g이 잘 혼합 구성 요소 20g을 결합하고, 무게는 알루미늄에 따르다 요리. 필요한 경우, 수지 블록 금형을 삽입하고 48~72시간을위한 55 ° C 오븐에서 경화에 수지를 따르고으로 준비하실 수 있습니다. </li><li> 프로필렌 산화물과 씻어서 좋은 브러시를 사용하여 RT에서 밤새 함침에 대한 Durcupan 수지로 프로필렌 산화물과 담가에서 섹션을 제거합니다. </li><li> 다음날, 알루미늄은 수지를 약화시키기 위해 10 분 동안 55 ° C 오븐에 요리를 넣어 무게. 프로필렌 산화물, 코팅 수지의 얇은 레이어와 ACLAR 퍼가기 필름과 씻어서 브러쉬를 사용하여 다른 퍼가기 영화로 커버하고, 골고루 (; 예 : 유리 튜브의 플라스틱 뚜껑을 위해 g 약 2) 가벼운 무게를 배포 섹션을 내려 놓 아라 위에 수지가 확산을 도울 것이다. 수지 중합 들어, 48~72시간에 대한 오븐 (55 ° C에서)에서 알을 품다. </li><li> 중합 후 섹션의 상단에 빛이 가중치 및 삽입 필름을 제거합니다. 쌍안경 현미경, 관심있는 사각형 영역을 (2x2 mm 정도)를 선택하고 면도날을 사용하여 영화에서 신중하게 소비세. </li><li> 접착제는 Superglue를 사용하여 수지 블록의 끝에 관심 영역 1 시간 동안 55 ° C 오븐에 치료. </li><li> sectioning 준비에서 면도날과 이등변 사다리꼴의 형태에 수지 블록을 잘라. </li><li> ultramicrotome 및 유리 칼을 사용하여 조직의 표면에서 접착제와 수지를 제거합니다. 더블 증류수와 함께 유리 칼의 보트를 입력하고 몇 반 얇은 섹션 (0.5-1 μm의 두께) 했네요. </li><li> 완벽한 루프와 SuperFrost 슬라이드 섹션을 전송합니다. ° C 1 분 80 열판에 슬라이드를 삽입하여 섹션을 건조. 1 분 0.1 % toluidine 파란색 얼룩 (2g의 나트륨 borate 200 ML 더블 증류수 0.2 g toluidine 파란색)의 몇 방울로 커버. 더블 증류수로 얼룩 초과를 씻어. 가벼운 현미경으로 섹션의 심사는 수지 (그림 2)에서 스테인드 조직을 구별할 수 있도록합니다. </li><li> 조직과 수지의 경계는 부분의 중앙에 도달할 때까지 절단 이력서. 다음 절차는 훈련이 필요합니다. 다이아몬드 칼로 유리 칼을 교체하고 두 번 증류수로 배를 채우십시오. 실버 - 골드 ultrathin 섹션 (60-80 nm의 두께)에 은색을 잘라 조심스럽게 좋은 거꾸로 핀셋을 사용하여 구리 메쉬 그리드에 그들을 수집합니다. 필터 종이에 그리드를 건조시킵니다. </li><li> 콘트라스트를 향상시키기 위해, ultrathin 섹션은 리드 구연 산염 (10 ML 더블 증류수 1 0.03 g 리드 구연 산염 및 0.1 ML 10N 수산화 나트륨) 물들일 수 있습니다. 좋은 거꾸로 핀셋을 사용하여 2 분 동안 리드 구연 산염의 드롭에 격자를 전송합니다. 격자를 제거하고 정교한 이중 증류수 3 연속 목욕탕에서 씻어. 마지막으로, 필터 종이에 그리드를 건조하고 전자 현미경 검사 (그림 3-6)까지 그리드 상자에 저장합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 빛의 미세한 수준에서 Iba1 묻은 섹션을 참조하십시오. Iba1의 세포 분포는 immunostaining의 특이성을 보여줍니다 microglia로 제한됩니다. 스케일 바 = 100 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 빛의 미세한 수준에서 그림 2. Toluidine 푸른 스테인드 세미 얇은 섹션을 참조하십시오. immunostaining은 전자 현미경에서 가장 강렬 나타납니다 조직과 수지의 경계를 적어 둡니다. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 전자 현미경 수준에서 Iba1 - immunopositive microglial perikaryon 및 프로세스를 보여주는 그림 3. Ultrathin 섹션. Iba1 - 긍정적인 구조 요소들​​은 immunoperoxidase - DAB 전자 - 밀도 침전물로 인정받고 있습니다. 스케일 바 = 2 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 전자 미세한 수준에서 서로 다른 크기와 모양의 Iba1 - immunopositive microglial 프로세스를 표시하는 그림 4. Ultrathin 섹션. 스케일 바 = 2 μm의. E 5 "/&gt; 그림 5. 그 세포 organelles의 식별을 가능하게 높은 배율의 그림 4에서 Iba1 - 긍정적인 microglial 과정을 보여주는 Ultrathin 섹션. 스케일 바 = 1 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 높은 배율에서 Iba1 - 긍정적인 microglial 프로세스와 시냅스를 포함한 neuropil 주변 요소 사이의 ultrastructural 관계를 드러내는 그림 6. Ultrathin 섹션. 스케일 바 = 1μm.

<ol><li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li>
<li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li>
<li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li>
<li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기 우리는 최적의 ultrastructural 보존 및 절차 엄격하게 수행됩니다 immunocytochemical 감지, 사이 좋은 타협을 제공 immunoelectron 현미경에 대한 마우스 뇌 조직의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. TEM과 결합,이 방법은 몇 가지 독특한 기능과 식별 기준으로 세포 요소를 구분할 수 있습니다. 특히, Iba1의 immunoperoxidase - DAB의 얼룩은 neuropil 내에 microglial perikarya 및 프로세스를 식별하는,뿐만 아니라 형태, 세포 organelles 및 기타 휴대 요소 (그림 3-6)와 ultrastructural 관계를 분석할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 ultrastructural glial이나의 연결 요소에 용해 또는 멤브레인 - 바운드 단백질의 위치뿐만 아니라 세포 organelles 그들의 연관 관계를 분석하실 수 있습니다. 사실, 특정 항체이 프로토콜을 사용하여, 우리는 이전에 5 ...

* 하나는 항상 퓸 후드 아래의 작업과 acrolein, paraformaldehyde, 그리고 오스뮴 처리 또한 적절하게 자신의 폐기물의 처분해야 할 때 nitrile 장갑을 착용해야합니다.

immunoelectron 현미경을위한 마우스 뇌 조직의 준비

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

전송 전자 현미경 (TEM)은에서 중추 신경계에 microglial, oligodendrocytic astrocytic와의 연결을 subcellular 구획 (dendrite, 돌기 척추, 축삭, 축삭 터미널, perikaryon),뿐만 아니라 자신의 세포 organelles과 cytoskeleton을 시각화를위한 매우 유용합니다 높은 공간 해상도. 로 표시, TEM과 결합하여, 사전 퍼가기의 immunocytochemistry는 몇 가지 독특한 기능과 식별 기준 (예, microglial perikarya 및 프로세스, microglia 특정 마커 Iba1 (이온화 칼슘 바인딩 어댑터 분자 하나에 대한 항체를 사용하는 경우와 세포 요소의 차별을 허용 여기에)), 신경 전달 물질의 세포 요소의 내용 (예 : serotonergic) 및 ultrastructural 가용성이나 멤브레인 - 바운드 단백질의 지방화 (예 : 5 HT1A 및 EphA4 수용체)를 식별. 여기, 우리는 acrolein 정착액, 뇌 섹션의 sectioning 제거 및 sectioning 뇌뿐만 아니라 immunoperoxidase - diaminobenzidine (DAB) 얼룩, 수지 포함하고, ultrathin와 생쥐의 transcardiac 재관류에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 절차가 완료되면 immunostained 자료 TEM과 시험 준비가되었습니다. 엄격하게 수행하는 경우,이 기술은 최적의 ultrastructural 보존과 immunocytochemical 검출 사이 좋은 타협을 제공합니다.

우리는 두뇌 섹션 sectioning 마우스, 제거 및 sectioning 뇌뿐만 아니라, immunoperoxidase의 얼룩, 수지 포함하고, ultrathin의 transcardiac 재관류에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 절차가 완료되면 immunostained 자료 전송 전자 현미경과 함께 시험에 대한 준비가되었습니다.

Immunoelectron 현미경을위한 마우스 뇌 조직의 준비

투과전자현미경(TEM)은 미세아교세포, 희소돌기아교세포, 성상교세포 및 신경세포의 세포 내 소기관을 시각화하는 데 매우 유용합니다...

본 절차의 전반적인 목표는 면역 전자 현미경 관찰을 위해 마우스 뇌 조직을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 동물의 관류를 통해 뇌를 고정함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 뇌를 절단하고 면역 조직 화학 염색을 위해 절편을 처리하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 섹션을 고정하고 탈수 및 포매하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 초박절편을 제작하는 것입니다. 결과적으로, 중추신경계의 서로 다른 영역과 세포 유형 내에서 다양한 단백질의 분포를 높은 공간 해상도로 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 신경생물학 및 해부학과의 Esca 연구실 소속 Maria Trombley입니다. 오늘은 면역 전자 현미경 관찰을 위한 마우스 뇌 조직 준비 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 발달 과정, 경험 의존적 가소성 및 노화 과정 중 미세아교세포와 시냅스 간의 상호작용을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작하겠습니다. 심장 관류를 통해 마우스 뇌를 고정한 후, 4°C의 포름알데히드 약 10mL에서 2시간 동안 후고정합니다. 4°C의 1XPBS에서 진동기(vibrator)를 사용하여 10분씩 3회 세척하고, 즉시 차가운 1XPBS를 사용하여 뇌를 50µm 두께의 횡단면으로 절편화합니다.가는 붓을 사용하여 선택한 절편들을 4 °C의 1×PBS가 채워진 유리 바이알로 옮깁니다. 나머지 절편들은 Cryoprotectant에 넣어 -20 °C에서 보관하며, 이렇게 하면 수년간 변형 없이 보관할 수 있습니다. 각 유리 바이알당 최대 10개의 부유 절편을 염색 공정에 사용하십시오.트랜스퍼 피펫을 사용하여 1X PBS를 신선한 0.1% Sodium borohydride in PBS로 교체하되, 절편이 건조해지는 것을 방지하기 위해 빠르게 용액을 교체하십시오. 30분 동안 배양한 후, 1X PBS로 10분씩 3회 세척합니다. 이때 모든 기포가 제거되도록 주의하십시오. 그 후 0.5% gelatin과 사용할 2차 항체에 적합한 5% normal serum이 포함된 1X PBS로 블로킹합니다.2시간 동안 배양합니다. 블로킹 용액에 희석한 1차 항체를 첨가합니다. 48시간 동안 배양합니다.1X PBS로 10분 동안 3회 세척합니다. 블로킹 용액에 희석한 비오틴 결합 2차 항체와 함께 2시간 동안 배양합니다. 이전과 동일하게 1X PBS로 10분 동안 3회 세척합니다.블로킹 용액에 희석한 streptavidin horseradish peroxidase와 함께 1시간 동안 배양합니다. 절편을 1 XPBS로 1회, 1 XTBS로 2회, 각각 10분 동안 세척합니다. 표지를 시각화하기 위해 1 XTBS에 0.05%dab 및 0.01%hydrogen peroxide가 포함된 신선하게 조제된 용액으로 절편을 배양합니다.염색색이 육안으로 진한 갈색으로 변하거나 반응이 5분 동안 진행되면, 반응을 중단시키기 위해 1X TBS로 절편을 헹굽니다. 그다음 1X TBS로 한 번, 1X PB로 두 번, 각각 10분 동안 헹굽니다. 흄 후드 내에서 세밀한 붓을 사용하여 절편을 1X PB가 채워진 멀티웰 배양 플레이트로 옮깁니다.세밀한 브러시를 사용하여 웰 하나에서 PB를 제거하고 절편을 즉시 평평하게 폅니다. 다음 웰로 이동하기 전에 1% osmium tetroxide-1x PB 용액을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. OSM 절편을 유리 바이알로 옮깁니다.XPB로 10분씩 3회 헹굽니다. 에탄올 농도를 점차 높여 절편을 탈수시킵니다. 그다음 본 프로토콜의 본문에 설명된 대로 프로필렌 옥사이드를 처리합니다.프로필렌 옥사이드로 헹군 미세 붓을 사용하여 절편을 새로 준비한 듀판트(dupant) 수지에 옮깁니다. 밤새 침투시키기 위해 절편이 담긴 접시를 55 °C 오븐에 10분 동안 넣습니다. 수지를 부드럽게 하기 위해 프로필렌 옥사이드로 헹군 붓을 사용하여 클로르(chlor) 매립 필름에 수지를 얇게 도포합니다.절편을 필름 위로 옮기고 다른 매립 필름으로 덮습니다. 레진이 잘 퍼지도록 그 위에 약 2g의 가벼운 무게추를 고르게 배치합니다. 인큐베이터에서 55°C로 48~72시간 동안 레진을 중합시킵니다. 중합 후, 실체 현미경 하에서 상단 매립 필름의 무게추를 제거합니다.2 by 2 mm 크기의 관심 영역을 선택하고 면도날을 사용하여 필름에서 이를 절제합니다. 관심 영역을 레진 블록의 끝부분에 순간접착제로 고정합니다. 55 °C 인큐베이터에서 1시간 동안 경화시킵니다.면도날을 사용하여 레진 블록을 초박절편 흡입(suctioning)에 최적화된 형태인 이등변 사다리꼴 모양으로 다듬습니다. 마이크로톰과 유리 칼을 사용하여 조직 표면의 접착제를 제거함으로써 평평한 표면을 만듭니다. 흡입을 위해서입니다.글라스 나이프의 보트에 2회 증류수를 채우고 0.5~1 µm 두께의 절편을 몇 개 제작합니다. perfect loop를 사용하여 절편을 super frost 슬라이드로 옮깁니다. 80 °C 가열판에서 1분 동안 건조한 후, 0.1% toluidine blue로 1분 동안 염색합니다.분무병을 사용하여 이중 증류수로 과도한 염색약을 씻어냅니다. 광학 현미경으로 절편을 관찰하여 염색된 조직과 레진을 구별합니다. 조직과 레진의 경계가 절편의 중앙 부근에 도달할 때까지 준박절편(semi-thin section)을 제작합니다. 유리 칼을 다이아몬드 칼로 교체하고 보트에 이중 증류수를 채웁니다.은-금 초박절편으로 절단합니다. 두께 60 to 80 nanometers로 섹션을 만듭니다. 미세 역핀셋을 사용하여 구리 메쉬 그리드 위에 섹션을 조심스럽게 수집합니다.대조도를 높이기 위해 그리드를 여과지 위에서 건조합니다. 정밀 도말용 핀셋을 사용하여 그리드를 납 시트르산(lead citrate) 한 방울에 2분 동안 담급니다. 그리드를 2회 증류수(double distilled water)가 담긴 세 개의 수조에 차례로 넣어 조심스럽게 세척합니다.그리드를 여과지에 올려 건조시킨 후, 전자현미경으로 추후 관찰할 수 있도록 그리드 보관함에 저장하십시오. 전자현미경으로 그리드를 관찰하여 면역염색 상태뿐만 아니라 세포 요소의 형태, 즉 세포 내 소기관과 소기관 간의 상호 관계를 시각화하십시오.여기 IBA one의 대표적인 면역 염색 결과가 광학 현미경 수준에서 나타나 있습니다. IBA one의 세포 분포는 미세아교세포로 제한되며, 이는 전자 현미경 수준에서 그 특이성을 확인시켜 줍니다. IBA one으로 면역 염색된 미세아교세포의 세포체와 돌기가 관찰됩니다.면역 과산화효소 DAB 염색은 전자 밀도가 높은 침전물로 나타납니다. IBA1 면역 염색된 미세아교세포 돌기의 다른 예시들은 다양한 크기와 모양을 보여줍니다. 고배율 관찰 시, 하나의 미세아교세포 돌기 내부의 다양한 세포 내 소기관들과, 또 다른 미세아교세포 돌기와 시냅스를 포함한 주변 신경망 요소들 사이의 초미세 구조적 관계가 드러납니다.지금까지 면역 전자 현미경 관찰을 위한 마우스 뇌 조직 준비 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 단계를 엄격히 준수하고 뇌 조직을 세심하게 다루는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 마우스 뇌 절편의 Meynert 영역의 핵 기저부에 있는 콜린성 섬유의 면역조직화학적 염색을 보여줍니다. 절편을 차단하고 콜린 아세틸전이효소에 대한 1차 투여한 후 비오틴화된 2차 항체를 투여합니다. Avidin-biotin-peroxidase 복합체가 추가되어 2차 항체에 결합한 다음 발색 기질에 결합합니다. 그런 다음 단면을 탈수하고 장착한 후 현미경으로 시각화합니다.

마우스 뇌의 Meyner의 핵 기저부에서 신경 섬유의 면역조직화학적 염색

출처: Kummari, E., et. al., Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the isolation of individual dopamine neurons and the entire ventral tegmental area., J. vis. exp. (2015)이 비디오에서는 후속 레이저 캡처 미세해부를 위한 뇌 조직 절편의 도파민 뉴런에 대한 면역조직화학 프로토콜을 시연합니다.

도파민 뉴런을 표적으로 하기 위한 마우스 뇌 조직 절편의 면역조직화학(Immunohistochemistry of mouse brain tissue sections for targeting dopamine neurons)

출처: Schönherr, S., et. al. 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특이적 배열을 조사하기 위해 광유전학 및 동결 파괴 복제 면역 라벨링을 결합했습니다. J. Vis. 특급. (2016)이 비디오는 전자 현미경을 위한 마우스 뇌 조직의 동결 파괴 복제본의 면역 라벨링을 보여줍니다. 파쇄되고 코팅된 복제품은 수용체를 노출시키기 위해 소화됩니다. 1차 및 골드 태그가 지정된 2차 항체를 추가하여 특정 신경세포막 수용체를 표지합니다. 복제본은 그리드에 장착되고 전자 현미경으로 시각화됩니다.

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

출처: Louth, E. L., et al. Golgi-Cox 방법을 사용하여 두꺼운 뇌 절편 내의 뉴런을 이미징합니다. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 Golgi-Cox로 염색된 두꺼운 뇌 절편에서 상부 및 하부 초점 경계를 설정하고 겹치는 이미지를 캡처하여 뉴런을 이미징하는 방법을 보여줍니다. 상세한 뉴런 투영을 보장하기 위해 여러 위치를 이미지화하고, 이를 결합하여 3D 표현을 생성합니다.

Golgi-Cox 금속 염색을 사용한 마우스 뇌 절편의 뉴런 현미경 이미징

이 문서에서 우리는 높은 해상도, 형광 표지 된 마우스의 뇌의 미세 뇌 해부학과, 재구성하는 전체 실험 절차를 설명합니다. 설명 프로토콜은 샘플 준비 및 청소, 영상, 데이터 후 처리 및 다중 스케일의 시각화를 위해 설치 표본이 포함되어 있습니다.

공 초점 빛 시트 현미경 전체 마우스 두뇌의 마이크론 규모의 해상도 광학 단층 촬영

여기, 우리는 쉽게, 낮은 비용을 제공하고, 시간 효율적인 프로토콜은 화학적으로 투과 전자 현미경에 대한 면역 조직 화학 염색을 미리 내장과 호환되는 장기 보존을 허용, 아크롤레인 정착액와 영장류 뇌 조직을 고정 할 수 있습니다.

면역 조직 화학 및 전자 현미경을 사전은 임베딩에 대한 비 인간 영장류 뇌 조직의 준비

여기, 우리 면역 형광 염색 법을 사용 하 여 마커 단백질, confocal 현미경 검사 법 및 컴퓨터 기반 분석 시 냅 스 단백질의 분포를 결정 하는 양적 접근 방식을 설명 합니다.

면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

이 보고는 면역성 화학을 위한 동결된 마우스 망막 단면도를 준비하기 위한 포괄적인 방법을 기술합니다 (IHC).  설명된 방법은 안구 후방 컵의 해부, 파라포름알데히드 고정, 최적 절삭 온도(OCT) 매체 및 조직 배향에 포함, 단면화 및 면역 염색을 포함한다.

면역 조직 화학을 위한 마우스 망막 극저온 단면도 단면도의 준비

이 프로토콜은 다중 표지 FISH 및 형광 IHC 신호를 달성하는 것을 목표로 신선 냉동 및 고정 마우스 뇌 절편 모두에서 형광 in situ hybridization(FISH)과 형광 면역조직화학(IHC)을 결합하는 방법을 설명합니다. IHC는 세포질 및 막 부착 단백질을 표적으로 삼았습니다.

Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Section(신선 냉동 또는 고정 마우스 뇌 절편에서 Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization과 형광 면역조직화학의 결합)

이 프로토콜은 관류, 뇌 단면, 자유 부동 면역 염색, 조직 마운팅 및 이미징을 포함한 마우스 뇌 조직학 연구를위한 효율적이고 재현 가능한 접근 방식을 설명합니다.

마우스 뇌의 자유 부동 면역 염색

유도성 트랜스제닉 계보 추적 마우스 라인을 사용하여 줄기 세포 및 그의 자손을 형광단으로 영구적으로 표시하는 능력은 생체내에서 활성화, 증식, 이동 및/또는 분화의 공간적 및 시간적 분석을 가능하게 한다. 계보 추적은 혈통 헌신, 개입에 대한 반응 및 다능성에 대한 새로운 정보를 나타낼 수 있습니다.

성인 마우스 뇌에서 유도성 형광 표지 줄기 세포의 계보 추적

배우세요 마우스 뇌 조직을 면역전자현미경용으로 준비하는 방법을. 경심장 관류 고정, 뇌 절단, 면역효소 염색을 포함한 이 프로토콜은 중추신경계 단백질 분포를 고해상도로 시각화하여 신경과학 연구에 필수적인 세포 구조 이해를 제공합니다.

Immunoelectron 현미경을위한 마우스 뇌 조직의 준비

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