Immunoelectron 현미경을위한 마우스 뇌 조직의 준비

본 실험 절차의 전체적인 목적은 면역 전자 현미경 관찰을 위해 마우스 뇌 조직을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 동물의 관류를 통해 뇌를 고정함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 뇌를 절단하고 면역조직화학 분석을 위해 절편을 처리하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 절편을 고정, 탈수 및 매몰하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 초박절편을 제작하는 것입니다. 최종적으로, 중추신경계의 서로 다른 영역과 세포 유형 내에서 다양한 단백질의 분포를 높은 공간 해상도로 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 로체스터 대학교 신경생물학 및 해부학과의 Esca 실험실 소속 Maria Trombley입니다. 오늘은 면역 전자 현미경 관찰을 위한 마우스 뇌 조직 준비 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 발달 과정, 경험 의존적 가소성 및 노화 과정 중 미세아교세포와 시냅스 사이의 상호작용을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

그럼 시작하겠습니다. 심장 내 관류를 통해 마우스 뇌를 고정한 후, 4°C에서 약 10 mL의 포름알데히드 용액으로 2시간 동안 후고정합니다. 진동기(vibrator)와 얼음처럼 차가운 1X PBS를 사용하여 4°C의 1X PBS로 뇌를 10분씩 3회 세척합니다. 즉시 뇌를 50 µm 두께의 횡단면으로 절편화합니다.

세밀한 붓을 사용하여 선택한 절편들을 4 °C의 1X PBS가 채워진 유리 바이알로 옮깁니다. 남은 절편들은 -20 °C의 Cryoprotectant에 보관하며, 이를 통해 변형 없이 최대 수년간 보관할 수 있습니다. 각 유리 바이알당 염색을 위해 최대 10개의 부유 절편을 처리하십시오.

트랜스퍼 피펫을 사용하여 1X PBS를 신선한 0.1% Sodium borohydride in PBS 용액으로 교체하며, 절편이 마르지 않도록 빠르게 용액을 교체하십시오. 30분 동안 인큐베이션한 후, 1X PBS로 10분씩 3회 헹굽니다. 모든 기포를 제거하는 데 주의하며, 사용할 2차 항체에 적합한 0.5% gelatin 및 5% normal serum이 포함된 1X PBS로 블로킹하십시오.

2시간 동안 배양합니다. 블로킹 용액에 희석한 1차 항체를 첨가합니다. 48시간 동안 배양합니다.

1X PBS로 10분 동안 3회 세척합니다. 블로킹 용액에 희석한 biotin 결합 2차 항체와 함께 2시간 동안 배양합니다. 이전과 동일하게 1X PBS로 10분 동안 3회 세척합니다.

블로킹 용액에 희석한 streptavidin horseradish peroxidase와 함께 1시간 동안 배양합니다. 절편을 1xPBS로 한 번, 1xTBS로 두 번, 각각 10분 동안 세척합니다. 라벨링을 시각화하기 위해 1xTBS에 0.05% dab와 0.01% hydrogen peroxide가 포함된 신선하게 조제된 용액으로 절편을 배양합니다.

염색 색상이 육안으로 짙은 갈색으로 변하거나 반응이 5분 동안 진행되면, XTBS 1배액으로 절편을 헹구어 반응을 중단시킵니다. 그 다음 XTBS 1배액으로 한 번, PB 1배액으로 두 번, 각각 10분 동안 헹굽니다. 흄 후드 내에서 세밀한 붓을 사용하여 절편을 PB 1배액이 채워진 멀티웰 배양 플레이트로 옮깁니다.

미세 붓을 사용하여 웰 하나에서 PB를 제거하고, 즉시 절편들을 평평하게 폅니다. 다음 웰로 넘어가기 전에 1x PB에 1% osmium tetroxide를 녹인 용액을 첨가하고, 상온에서 30분 동안 배양합니다. OSM 절편들을 유리 바이알로 옮깁니다.

XPB로 10분씩 3회 헹굽니다. 에탄올 농도를 점차 높여 절편을 탈수시킵니다. 그 다음, 본 프로토콜의 본문에 설명된 대로 프로필렌 옥사이드를 처리합니다.

프로필렌 옥사이드로 헹군 미세 붓을 사용하여 절편을 갓 준비한 dupant 수지로 옮깁니다. 하룻밤 동안 침투시키기 위해, 절편이 담긴 접시를 55 °C 오븐에 10분 동안 둡니다. 수지를 부드럽게 하려면, 프로필렌 옥사이드로 헹군 붓을 사용하여 chlor 매립 필름에 수지를 얇게 도포합니다.

절편을 필름 위에 옮기고 다른 매립 필름으로 덮습니다. 수지가 잘 퍼지도록 위에 약 2g의 가벼운 무게추를 고르게 배치합니다. 인큐베이터에서 55 °C로 48~72시간 동안 수지를 중합시킵니다. 중합 후, 실체 현미경 하에서 상단 매립 필름의 무게추를 제거합니다.

2x2 mm 크기의 관심 영역을 선택하고 면도날을 사용하여 필름에서 이를 절제합니다. 관심 영역을 레진 블록의 팁에 순간접착제로 고정합니다. 55 °C 인큐베이터에서 1시간 동안 경화시킵니다.

면도날을 사용하여 레진 블록을 초박절편 흡입에 최적화된 형태인 이등변 사다리꼴 모양으로 다듬습니다. 마이크로톰과 유리 칼을 사용하여 조직 표면의 접착제를 제거함으로써 평평한 표면을 만듭니다. 이는 흡입 공정을 위한 것입니다.

유리 칼의 보트에 이중 증류수를 채우고 0.5에서 1 µm 사이의 절편을 몇 개 절단합니다. 퍼펙트 루프를 사용하여 절편을 슈퍼 프로스트 슬라이드로 옮깁니다. 80 °C 가열판에서 1분 동안 건조시킨 후, 0.1% 톨루이딘 블루로 1분 동안 염색합니다.

분무기를 사용하여 2중 증류수로 과잉 염색액을 씻어냅니다. 광학 현미경 하에서 절편을 관찰하여 염색된 조직과 레진을 구분합니다. 조직과 레진의 경계가 절편의 중앙 부근에 도달할 때까지 준박절편(semi thin section)을 제작합니다. 유리 칼을 다이아몬드 칼로 교체하고 보트(boat)에 2중 증류수를 채웁니다.

은 시편을 초박절편으로 절단합니다. 두께는 60에서 80 nanometers로 설정합니다. 미세 도립 핀셋을 사용하여 절단된 단면을 구리 메쉬 그리드 위에 조심스럽게 수집합니다.

대조도를 높이기 위해 필터 페이퍼 위에서 그리드를 건조합니다. 미세 역핀셋을 사용하여 그리드를 납 시트르산(lead citrate) 한 방울에 2분 동안 담급니다. 그리드를 2중 증류수가 담긴 세 개의 수조에 차례대로 담가 조심스럽게 세척합니다.

그리드를 여과지에 말린 후, 추후 전자현미경 관찰을 위해 그리드 박스에 보관하십시오. 전자현미경으로 그리드를 관찰하여 면역염색 상태뿐만 아니라 세포 요소의 형태, 즉 세포 내 소기관과 그들 간의 상호 관계를 시각화하십시오.

여기 광학 현미경 수준에서 관찰한 IBA one의 대표적인 면역염색 결과가 제시되어 있습니다. IBA one의 세포 분포는 미세아교세포로 국한되며, 이는 전자 현미경 수준에서의 특이성을 확인시켜 줍니다. 면역염색된 미세아교세포의 세포체 주변과 돌기들이 관찰됩니다.

이뮤노퍼옥시다제 DAB 염색은 전자 밀도가 높은 침전물로 나타납니다. IBA1 면역 염색된 미세아교세포 돌기의 다른 예시들은 다양한 크기와 모양을 보여줍니다. 더 높은 배율에서는 미세아교세포 돌기 중 하나 내부의 다양한 세포 내 소기관들과, 또 다른 미세아교세포 돌기와 시냅스를 포함한 주변 신경망 요소들 사이의 초미세 구조적 관계가 드러납니다.

지금까지 면역 전자 현미경 검사를 위한 마우스 뇌 조직 준비 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 단계를 엄격히 준수하고 뇌 조직을 세심하게 다루는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.