Immunoelectron 현미경을위한 마우스 뇌 조직의 준비

본 절차의 전반적인 목표는 면역 전자 현미경 관찰을 위해 마우스 뇌 조직을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 동물의 관류를 통해 뇌를 고정함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 뇌를 절단하고 면역 조직 화학 염색을 위해 절편을 처리하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 섹션을 고정하고 탈수 및 포매하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 초박절편을 제작하는 것입니다. 결과적으로, 중추신경계의 서로 다른 영역과 세포 유형 내에서 다양한 단백질의 분포를 높은 공간 해상도로 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 신경생물학 및 해부학과의 Esca 연구실 소속 Maria Trombley입니다. 오늘은 면역 전자 현미경 관찰을 위한 마우스 뇌 조직 준비 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 발달 과정, 경험 의존적 가소성 및 노화 과정 중 미세아교세포와 시냅스 간의 상호작용을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작하겠습니다. 심장 관류를 통해 마우스 뇌를 고정한 후, 4°C의 포름알데히드 약 10mL에서 2시간 동안 후고정합니다. 4°C의 1XPBS에서 진동기(vibrator)를 사용하여 10분씩 3회 세척하고, 즉시 차가운 1XPBS를 사용하여 뇌를 50µm 두께의 횡단면으로 절편화합니다.

가는 붓을 사용하여 선택한 절편들을 4 °C의 1×PBS가 채워진 유리 바이알로 옮깁니다. 나머지 절편들은 Cryoprotectant에 넣어 -20 °C에서 보관하며, 이렇게 하면 수년간 변형 없이 보관할 수 있습니다. 각 유리 바이알당 최대 10개의 부유 절편을 염색 공정에 사용하십시오.

트랜스퍼 피펫을 사용하여 1X PBS를 신선한 0.1% Sodium borohydride in PBS로 교체하되, 절편이 건조해지는 것을 방지하기 위해 빠르게 용액을 교체하십시오. 30분 동안 배양한 후, 1X PBS로 10분씩 3회 세척합니다. 이때 모든 기포가 제거되도록 주의하십시오. 그 후 0.5% gelatin과 사용할 2차 항체에 적합한 5% normal serum이 포함된 1X PBS로 블로킹합니다.

2시간 동안 배양합니다. 블로킹 용액에 희석한 1차 항체를 첨가합니다. 48시간 동안 배양합니다.

1X PBS로 10분 동안 3회 세척합니다. 블로킹 용액에 희석한 비오틴 결합 2차 항체와 함께 2시간 동안 배양합니다. 이전과 동일하게 1X PBS로 10분 동안 3회 세척합니다.

블로킹 용액에 희석한 streptavidin horseradish peroxidase와 함께 1시간 동안 배양합니다. 절편을 1 XPBS로 1회, 1 XTBS로 2회, 각각 10분 동안 세척합니다. 표지를 시각화하기 위해 1 XTBS에 0.05%dab 및 0.01%hydrogen peroxide가 포함된 신선하게 조제된 용액으로 절편을 배양합니다.

염색색이 육안으로 진한 갈색으로 변하거나 반응이 5분 동안 진행되면, 반응을 중단시키기 위해 1X TBS로 절편을 헹굽니다. 그다음 1X TBS로 한 번, 1X PB로 두 번, 각각 10분 동안 헹굽니다. 흄 후드 내에서 세밀한 붓을 사용하여 절편을 1X PB가 채워진 멀티웰 배양 플레이트로 옮깁니다.

세밀한 브러시를 사용하여 웰 하나에서 PB를 제거하고 절편을 즉시 평평하게 폅니다. 다음 웰로 이동하기 전에 1% osmium tetroxide-1x PB 용액을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. OSM 절편을 유리 바이알로 옮깁니다.

XPB로 10분씩 3회 헹굽니다. 에탄올 농도를 점차 높여 절편을 탈수시킵니다. 그다음 본 프로토콜의 본문에 설명된 대로 프로필렌 옥사이드를 처리합니다.

프로필렌 옥사이드로 헹군 미세 붓을 사용하여 절편을 새로 준비한 듀판트(dupant) 수지에 옮깁니다. 밤새 침투시키기 위해 절편이 담긴 접시를 55 °C 오븐에 10분 동안 넣습니다. 수지를 부드럽게 하기 위해 프로필렌 옥사이드로 헹군 붓을 사용하여 클로르(chlor) 매립 필름에 수지를 얇게 도포합니다.

절편을 필름 위로 옮기고 다른 매립 필름으로 덮습니다. 레진이 잘 퍼지도록 그 위에 약 2g의 가벼운 무게추를 고르게 배치합니다. 인큐베이터에서 55°C로 48~72시간 동안 레진을 중합시킵니다. 중합 후, 실체 현미경 하에서 상단 매립 필름의 무게추를 제거합니다.

2 by 2 mm 크기의 관심 영역을 선택하고 면도날을 사용하여 필름에서 이를 절제합니다. 관심 영역을 레진 블록의 끝부분에 순간접착제로 고정합니다. 55 °C 인큐베이터에서 1시간 동안 경화시킵니다.

면도날을 사용하여 레진 블록을 초박절편 흡입(suctioning)에 최적화된 형태인 이등변 사다리꼴 모양으로 다듬습니다. 마이크로톰과 유리 칼을 사용하여 조직 표면의 접착제를 제거함으로써 평평한 표면을 만듭니다. 흡입을 위해서입니다.

글라스 나이프의 보트에 2회 증류수를 채우고 0.5~1 µm 두께의 절편을 몇 개 제작합니다. perfect loop를 사용하여 절편을 super frost 슬라이드로 옮깁니다. 80 °C 가열판에서 1분 동안 건조한 후, 0.1% toluidine blue로 1분 동안 염색합니다.

분무병을 사용하여 이중 증류수로 과도한 염색약을 씻어냅니다. 광학 현미경으로 절편을 관찰하여 염색된 조직과 레진을 구별합니다. 조직과 레진의 경계가 절편의 중앙 부근에 도달할 때까지 준박절편(semi-thin section)을 제작합니다. 유리 칼을 다이아몬드 칼로 교체하고 보트에 이중 증류수를 채웁니다.

은-금 초박절편으로 절단합니다. 두께 60 to 80 nanometers로 섹션을 만듭니다. 미세 역핀셋을 사용하여 구리 메쉬 그리드 위에 섹션을 조심스럽게 수집합니다.

대조도를 높이기 위해 그리드를 여과지 위에서 건조합니다. 정밀 도말용 핀셋을 사용하여 그리드를 납 시트르산(lead citrate) 한 방울에 2분 동안 담급니다. 그리드를 2회 증류수(double distilled water)가 담긴 세 개의 수조에 차례로 넣어 조심스럽게 세척합니다.

그리드를 여과지에 올려 건조시킨 후, 전자현미경으로 추후 관찰할 수 있도록 그리드 보관함에 저장하십시오. 전자현미경으로 그리드를 관찰하여 면역염색 상태뿐만 아니라 세포 요소의 형태, 즉 세포 내 소기관과 소기관 간의 상호 관계를 시각화하십시오.

여기 IBA one의 대표적인 면역 염색 결과가 광학 현미경 수준에서 나타나 있습니다. IBA one의 세포 분포는 미세아교세포로 제한되며, 이는 전자 현미경 수준에서 그 특이성을 확인시켜 줍니다. IBA one으로 면역 염색된 미세아교세포의 세포체와 돌기가 관찰됩니다.

면역 과산화효소 DAB 염색은 전자 밀도가 높은 침전물로 나타납니다. IBA1 면역 염색된 미세아교세포 돌기의 다른 예시들은 다양한 크기와 모양을 보여줍니다. 고배율 관찰 시, 하나의 미세아교세포 돌기 내부의 다양한 세포 내 소기관들과, 또 다른 미세아교세포 돌기와 시냅스를 포함한 주변 신경망 요소들 사이의 초미세 구조적 관계가 드러납니다.

지금까지 면역 전자 현미경 관찰을 위한 마우스 뇌 조직 준비 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 단계를 엄격히 준수하고 뇌 조직을 세심하게 다루는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.