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암 연구
0 조회수 • 3:19 분 • April 30th, 2023
렌티바이러스는 RNA 유전물질을 함유한 레트로바이러스입니다. 이 바이러스는 암 세포주에 전이 유전자를 도입하는 효율적이고 안정적인 방법을 제공합니다. 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 렌티바이러스(Lentivirus)가 들어 있는 튜브에 뉴라미니다아제(neuraminidase)를 첨가하는 것부터 시작합니다. 튜브를 섭씨 37도에서 1시간 동안 유지하면 바이러스의 결합 효율이 높아집니다.
다음으로, 종양 세포 현탁액이 포함된 튜브를 원심분리하여 펠릿을 형성합니다. 폴리브레렌을 함유한 유방구 배지를 추가하여 세포를 재현탁합니다. 폴리브레네는 렌티바이러스 감염 효율을 증가시키는 양이온성 고분자입니다. 이제 6개의 웰 조직 배양 플레이트에 웰당 최적의 종양 세포 수를 플레이트합니다. 배양 플레이트의 각 웰에 필요한 양의 렌티바이러스를 추가합니다.
접시를 휘둘러 내용물을 섞고 이산화탄소를 지속적으로 공급하면서 섭씨 37도에서 96시간 동안 유지합니다. 렌티바이러스는 세포에 들어가 RNA를 방출합니다. 바이러스 역전사 효소는 RNA를 숙주 게놈에 통합되는 이중 가닥 DNA로 변환합니다. 플레이트를 형광 현미경 아래에 놓고 성공적인 형질도입을 위해 세포를 모니터링합니다. 형질도입된 세포는 GFP 발현으로 인해 형광을 발합니다.
예시 프로토콜에서는 PDX가 해리된 종양 세포와 렌티바이러스 벡터의 형질도입을 수행합니다.
종양 세포를 형질도입하기 위해, 분리된 세포를 2ml의 유방권 배지에서 재현탁하기 위해 원심분리합니다. 계수 후, 세포를 다시 원심 분리하고 20 마이크로 리터의 폴리 브레렌을 보충 한 2 밀리리터의 유방 배지에 펠릿을 재현탁시킵니다. 다음으로, 10의 감염 다중성으로 세포에 대한 초저 접착 6 웰 조직 배양 플레이트와 렌티바이러스 입자를 웰 당 5 번째 생존 가능한 종양 세포에 2 배 10 플레이트
.플레이트를 소용돌이쳐 바이러스와 세포를 혼합하고 최대 96시간 동안 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 공동 배양을 배양하고 처음 24시간 후에 500마이크로리터의 신선한 유방권 배지를 추가합니다. 세포의 10% 이상이 GFP 양성인 경우, 적어도 하나의 웰에서 형질도입된 세포를 얼음 위의 15ml 원추형 튜브로 옮기고 1ml의 유방권 배지로 웰을 세척합니다.
세포와 함께 세척물을 풀링하고 종양 세포를 10ml의 HBSS와 HEPES로 원심분리합니다. 마지막으로, 얼음 위에 50마이크로리터의 기저 매트릭스 추출물에 세포를 재현탁시키고 내장된 세포를 0.5ml 인슐린 주사기에 넣어 재이식합니다.