직접 상호작용을 통한 3D 공동 배양: 암세포와 단핵구의 상호작용을 연구하기 위한 공동 배양

먼저 형광 염료 담금질 단백질 기질인 DQ collagen IV를 세포외 기질 추출물 또는 ECME에 추가합니다. 이 추출물을 두 개의 웰 슬라이드의 각 웰에 붓습니다. 첫 번째 우물은 공동 배양으로, 두 번째 우물은 대조군으로 표시합니다. 웰에 적당량의 형광 표지된 암세포 현탁액을 첨가하고 세포 부착을 촉진하기 위해 원하는 시간 동안 섭씨 37도에서 슬라이드를 배양합니다.

첫 번째 웰에 필요한 양의 단핵구 세포 현탁액을 추가합니다. ECME가 섭씨 37도에서 응고되도록 합니다. 암세포와 단핵구 배양 배지를 동일한 비율로 각 웰에 붓고 이산화탄소 환경에서 원하는 기간 동안 섭씨 37도에서 슬라이드를 배양합니다. 공동 배양 웰에서 암세포는 단핵구를 유인하기 위해 단핵구 화학유인 단백질과 같은 단백질을 분비합니다.

대조적으로, 단핵구는 기질 금속단백분해효소(MMP)를 생성하여 콜라겐을 분해하여 암세포의 침입을 촉진합니다. 컨포칼 현미경으로 슬라이드를 관찰합니다. DQ 콜라겐 분해는 형광을 방출하는데, 이는 세포 상호 작용을 나타내는 공동 배양 세포에서 더 많이 볼 수 있는 반면 대조 세포에서는 더 적습니다. 다음 프로토콜에서는 유방암 세포와 단핵구의 상호 작용을 연구하기 위해 유방암 세포를 공동 배양할 것입니다.

세포 배양 전에 BRC 세포 및 단핵구를 시판되는 쿠마린 및 로다민으로 라벨링하려면 관심 있는 6개의 BRC 세포에 2배의 10의 단층을 준비하고 표준 배지를 형광 염료의 충분한 예열 작업 용액으로 교체합니다. 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 환경에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 염료 용액을 흡인하고 충분한 1x PBS를 사용하여 세포를 부드럽게 헹굽니다.

PBS를 흡입하고 표준 매체를 추가합니다. 세포를 트립신화하기 위해 플라스크에 2ml의 0.05% 트립신과 0.48millimolar EDTA를 첨가하고 섭씨 37도에서 5-10분 동안 세포를 배양합니다. 트립신화를 중지하기 위해 200마이크로리터의 FBS를 추가하고 보충제 없이 해당 배지 7ml를 추가합니다.

피펫팅으로 세포를 재현탁시킨 다음 10마이크로리터의 세포를 Neubauer 챔버로 옮기고 계수합니다. 다음으로, 5 분 동안 실온에서 430 x g에서 세포를 펠렛 화 한 다음 상등액을 버리고 미리 데워진 형광 염료 작업 용액 밀리리터를 사용하여 세포를 현탁시킵니다.

세포를 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 환경에서 30분