Soft Agar Colony Formation Assay: 암세포 증식에 대한 새로운 화합물의 효과를 테스트하는 방법

시작하려면 원뿔형 튜브에 적절한 농도의 용융된 아가로스를 넣고 원하는 양의 따뜻한 배양 배지를 추가합니다. 내용물을 섞기 위해 부드럽게 뒤집습니다. 이 혼합물을 6웰 플레이트의 각 웰에 넣고 응고시키십시오. 이것은 맨 아래 레이어입니다. 다음으로, 관심 화합물로 암세포를 치료하고 필요한 농도의 아가로스를 첨가합니다.

이제 밀리리터당 원하는 수의 세포를 포함하는 이 혼합물을 각 웰에 붓습니다. 이것은 세포를 포함하는 계층입니다. 배지가 굳으면 일주일 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 배지에 아가로스를 혼합하여 피더 층을 준비하고 이 혼합물에 관심 화합물을 보충합니다. 이 피더 층을 각 웰에 부드럽게 추가하고 응고되도록 한 다음 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.

매주 이 섭식 절차를 반복하여 군체가 형성될 때까지 세포에 배지를 보충합니다. 관심 화합물이 종양 원성의 억제제인 경우, 세포 성장을 억제하여 웰에 몇 개의 콜로니가 생깁니다. 다음 프로토콜에서는 유방암 세포의 종양 원성에 대한 PADI 억제제의 효과를 연구하기 위해 부드러운 한천 집락 형성 분석을 수행할 것입니다.

3% 2-하이드록시에틸 아가로스를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 깨끗하고 건조한 100ml 유리병에 2-하이드록시에틸 아가로스 0.9g과 증류수 30ml를 넣습니다. 혼합물을 전자레인지에 15초 동안 돌리고 부드럽게 휘젓습니다. 아가로스 분말이 완전히 녹을 때까지 이 단계를 반복합니다. 다음으로, 병이 들어있는 용액을 15 분 동안 오토 클레이브합니다.

더 사용하기 전에 아가로스 용액을 실온으로 식히십시오. 취급 시 피펫에서 아가로스가 응고되는 것을 방지하기 위해 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5밀리리터 및 10밀리리터 피펫 여러 개를 예열합니다. 병 뚜껑을 부분적으로 풀고 미리 만들어진 3% 2-하이드록시에틸 아가로스 용액을 전자레인지에 15초 동안 돌립니다. 그런 다음 용액을 부드럽게 휘젓고 전자레인지에 15초 더 돌립니다.

아가로스 용액을 휘젓을 때 용액이 공기에 노출되면 위로 올라와 넘칠 수 있으므로 주의하십시오. 병에 고체 젤이 남아 있으면 전자레인지에 몇 초 더 돌립니다. 아가로스 용액이 들어있는 병을 다음 단계에서 섭씨 45도의 수조에 보관하여 아가로스 용액이 조기에 응고되는 것을 방지하십시오.

다음으로, 예열된 피펫을 사용하여 12ml의 예열된 매체를 멸균된 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 즉시 3% 아가로스 용액 3ml를 넣고 원뿔형 튜브를 부드럽게 뒤집어 아가로스를 매체와 혼합합니다. 그런 다음 이 혼합물을 2밀리리터를 기포를 형성하지 않고 6웰 배양판의 각 웰에 부드럽게 첨가합니다. 혼합물이 응고될 수 있도록 섭씨 4도의 평평한 표면에 1시간 동안 6웰 배양 플레이트를 수평으로 배양합니다.

혼합물이 응고된 후 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다. 이제 맨 아래 레이어를 사용할 준비가 되었습니다.

이 절차의 어려운 측면은 모든 세포가 균등하게 분포되어 있고 용융된 아가로스 겔이 각 웰에 첨가하기 전에 응고되지 않도록 하여 액체 아가로스 겔을 첨가하기 전에 세포가 배지에서 혼합되도록 하는 것입니다. 또한 피펫은 취급하는 동안 용액이 응고되는 것을 방지하기 위해 사전에 예열되어 있습니다.

세포 함유층을 준비하려면 먼저 MCF10DCIS 세포를 트립신화하고 밀리리터당 40,000개의 세포 농도로 희석합니다. 그런 다음 예열된 피펫을 사용하여 8ml의 배지를 가져와 멸균된 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 즉시 원뿔형 튜브에 3% 아가로스 2밀리리터를 넣고 부드럽게 뒤집어 아가로스를 매체와 혼합합니다. 거품이 생기지 않도록 하십시오.

다음으로, 세포 2ml를 채취하여 DMSO에서 2마이크로몰 BB-chlor-amidine으로 처리하거나 DMSO 단독으로 대조군으로 처리합니다. 처리 후, 세포를 0.6% 아가로스와 일대일 희석하여 혼합하여 1마이크로몰 BB-chlor-amidine의 최종 농도를 만듭니다. 그런 다음 세포-아가로스 혼합물 1ml를 6웰 배양판의 바닥층에 부드럽게 첨가합니다.

6웰 배양 플레이트를 섭씨 4도의 평평한 표면에 최소 15분 동안 수평으로 놓아 최상층이 굳을 수 있도록 합니다. 혼합물이 응고된 후 공급 층을 추가하기 전에 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 일주일 동안 놓습니다. 미리 만들어진 3% 2-하이드록시에틸 아가로스 용액을 이전과 같이 전자레인지에 돌리고 아가로스 용액 병을 섭씨 45도의 수조에서 평형을 이루어 공급층 준비를 시작합니다.

1ml의 3% 아가로스 용액과 9ml의 따뜻한 매체를 50ml 원뿔형 튜브에 혼합하고 부드럽게 뒤집어 아가로스를 매체와 혼합합니다. 기포가 형성되지 않도록 하십시오. 혼합물을 BB-chlor-amidine으로 처리한 후, 바닥과 부드러운 층을 포함하는 6-well culture plate의 각 well에 혼합물 1ml를 부드럽게 첨가합니다. 그런 다음 6웰 배양 플레이트를 섭씨 4도의 평평한 표면에 최소 15분 동안 수평으로 놓고 혼합물이 응고되도록 합니다.

피더 층이 응고된 후 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 콜로니 형성이 관찰될 때까지 세포에 새로운 배지를 보충하기 위해 기존 공급층에 1ml의 0.3% 아가로스 배지 처리 용액을 오버레이하여 매주 이 공급 절차를 반복합니다.