Soft Agar Colony Formation Assay: 암세포 증식에 대한 새로운 화합물의 효과를 테스트하는 방법

시작하려면 원뿔형 튜브에 적절한 농도의 용융된 아가로스를 넣고 원하는 양의 따뜻한 배양 배지를 추가합니다. 내용물을 섞기 위해 부드럽게 뒤집습니다. 이 혼합물을 6웰 플레이트의 각 웰에 넣고 응고시키십시오. 이것은 맨 아래 레이어입니다. 다음으로, 관심 화합물로 암세포를 치료하고 필요한 농도의 아가로스를 첨가합니다.

이제 밀리리터당 원하는 수의 세포를 포함하는 이 혼합물을 각 웰에 붓습니다. 이것은 세포를 포함하는 계층입니다. 배지가 굳으면 일주일 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 배지에 아가로스를 혼합하여 피더 층을 준비하고 이 혼합물에 관심 화합물을 보충합니다. 이 피더 층을 각 웰에 부드럽게 추가하고 응고되도록 한 다음 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.

매주 이 섭식 절차를 반복하여 군체가 형성될 때까지 세포에 배지를 보충합니다. 관심 화합물이 종양 원성의 억제제인 경우, 세포 성장을 억제하여 웰에 몇 개의 콜로니가 생깁니다. 다음 프로토콜에서는 유방암 세포의 종양 원성에 대한 PADI 억제제의 효과를 연구하기 위해 부드러운 한천 집락 형성 분석을 수행할 것입니다.

3% 2-하이드록시에틸 아가로스를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 깨끗하고 건조한 100ml 유리병에 2-하이드록시에틸 아가로스 0.9g과 증류수 30ml를 넣습니다. 혼합물을 전자레인지에 15초 동안 돌리고 부드럽게 휘젓습니다. 아가로스 분말이 완전히 녹을 때까지 이 단계를 반복합니다. 다음으로, 병이 들어있는 용액을 15 분 동안 오토 클레이브합니다.

더 사용하기 전에 아가로스 용액을 실온으로 식히십시오. 취급 시 피펫에서 아가로스가 응고되는 것을 방지하기 위해 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5밀리리터 및 10밀리리터 피펫 여러 개를 예열합니다. 병 뚜껑을 부분적으로 풀고 미리 만들어진 3% 2-하이드록시에틸 아가로스 용액을 전자레인지에 15초 동안 돌립니다. 그런 다음 용액을 부드럽게 휘젓고 전자레인지에 15초 더 돌립니다.

아가로스 용액을 휘젓을 때 용액이 공기에 노출되면 위로 올라와 넘칠 수 있으므로 주의하십시오. 병에 고체 젤이 남아 있으면 전자레인지에 몇 초 더 돌립니다. 아가로스 용액이 들어있는 병을 다음 단계에서 섭씨 45도의 수조에 보관하여 아가로스 용액이 조기에 응고되는 것을 방지하십시오.

다음으로, 예열된 피펫을 사용하여 12ml의 예열된 매체를 멸균된 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 즉시 3% 아가로스 용