Decellularizing Mammary Fat Pads: Mammary Fat Pads에서 세포외 기질 하이드로겔 도출

먼저, 트립신-EDTA 용액이 담긴 접시에 유방 지방 패드 또는 MFP를 넣고 원하는 기간 동안 배양하여 세포 기질 접착을 끊습니다. MFP를 탈이온수로 세척하고 스트레이너를 통해 걸러냅니다. 젓는 막대가 있는 비커에 티슈를 넣고 Triton X-100을 추가합니다. 조직의 세포외 기질에 있는 성장 인자에 영향을 주지 않고 세포를 용해시키기 위해 저어줍니다.

MFP를 걸러내고 탈이온수로 헹굽니다. 조직을 비커로 다시 옮기고 데옥시콜산을 첨가하여 나머지 세포를 용해시킵니다. 다음으로, MFP를 걸러내고 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 탈이온수가 들어 있는 비커에 넣어 오염을 방지합니다. 비커를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

MFP를 걸러내고 에탄올과 과아세트산이 들어 있는 비커에 넣습니다. 과아세트산은 조직의 세포외 기질의 강성을 증가시킵니다. 잠시 동안 저어주고 긴장 단계를 반복합니다. PBS로 MFP를 세척한 다음 탈이온수로 세척합니다. 변형된 MFP를 프로판-1-ol이 들어 있는 비커로 옮깁니다.

잠시 동안 저어주고 내용물을 걸러낸 다음 MFP를 탈이온수로 세척합니다. MFP를 건조시키고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 다음 프로토콜에서는 쥐 유방 지방 패드의 탈세포화를 수행합니다.

먼저 MFP를 5밀리리터의 트립신-EDTA 용액이 담긴 6cm 접시에 넣습니다. 접시에 70% 에탄올을 뿌리고 닦은 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 0.7mm 스트레이너를 사용하여 조직에 물을 세 번 부어 MFP를 탈이온수로 세척합니다. 집게를 사용하여 세척 사이에 조직을 수동으로 마사지하십시오.

다음으로, 섬세한 작업으로 조직을 잠시 말리고 닦고 무게를 잰다. 건조된 조직을 적절한 크기의 교반 막대가 들어 있는 사전 오토클레이브 비커에 넣고 조직 그램당 60ml의 3% t-옥틸페녹시 폴리에톡시에탄올로 조직을 덮습니다. 실온에서 1시간 동안 저어줍니다. 그런 다음 비커 내용물을 여과기에 버리십시오.

비커를 탈이온수로 헹구고 티슈에 붓습니다. 이 헹굼 과정을 두 번 더 반복하고 헹굼 사이에 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하십시오. 그 후, 섬세한 작업으로 조직을 잠시 말리고 닦고 무게를 잰다. 티슈와 교반 막대를 같은 비커에 다시 넣고 티슈 그램당 60ml의 4% 데옥시콜산으로 덮습니다. 실온에서 1시간 동안 저어줍니다.

그런 다음 비커의 내용물을 메쉬 스트레이너에 덤프합니다. 비커를 탈이온수로 헹구고 티슈에 붓습니다. 이 헹굼 과정을 두 번 더 반복하고 헹굼 사이에 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하십시오. 헹궈진 조직을 섬세한 작업으로 간단히 말리고 닦고 무게를 잰다.

건조된 조직을 1% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 신선한 탈이온수와 함께 같은 비커에 넣습니다. 비커를 파라핀 필름으로 단단히 덮고 밤새 섭씨 4도에서 그대로 둡니다. 다음날 비커 내용물을 여과기에 배출합니다. 섬세한 작업으로 조직을 간단히 말리고 닦고 무게를 잰다. 그런 다음 적절한 크기의 교반 막대가 있는 동일한 비커에 MFP를 놓습니다.

조직 1g당 4% 에탄올과 0.1% 과아세트산을 함유한 60ml의 용액으로 조직을 덮습니다. 실온에서 2시간 동안 저어줍니다. 비커의 내용물을 0.7mm 여과기에 버리십시오. 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하고 내용물을 비커에 다시 넣습니다. 조직 1g당 60mL의 1X PBS로 조직을 덮어 씻습니다.

실온에서 15분 동안 저어줍니다. 이 전체 세탁 과정을 한 번 더 반복합니다. 다음으로 비커의 내용물을 0.7mm 스트레이너에 버립니다. 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하고 내용물을 비커에 다시 넣습니다. 조직 1g당 60ml의 탈이온수로 조직을 덮어 씻습니다.

실온에서 15분 동안 저어줍니다. 이 전체 세탁 과정을 한 번 더 반복합니다. 세척된 조직을 섬세한 작업으로 간단히 말리고 닦고 무게를 잰다. 티슈와 내용물을 스트레이너에 넣고 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지합니다. 내용물을 다시 비커에 넣고 티슈 그램 당 60ml의 100% n-프로판올로 티슈를 덮습니다.

실온에서 1시간 동안 저어줍니다. 그런 다음 섬세한 작업으로 조직을 잠시 말리고 무게를 잰다. 조직과 내용물을 0.7mm 여과기에 넣고 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지합니다. 내용물을 비커에 다시 넣고 티슈 그램당 60밀리리터의 탈이온수로 덮어 티슈를 씻습니다.

실온에서 15분 동안 저어줍니다. 이 세탁 과정을 세 번 반복합니다. 그 후, 섬세한 작업 와이프에서 조직을 잠시 말리고 무게를 잰다. 조직을 라벨이 붙은 15ml 튜브로 옮기고 밤새 섭씨 영하 80도에서 얼립니다.