CTC Immunofluorescence Assay : 순환 종양 세포를 특성화하는 기술

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암 연구

0 조회수 • 4:05 분 • April 30th, 2023

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- 먼저 유체 전단 및 압력 손상으로부터 세포를 보호하는 결합 방지 용액을 사용하여 분리된 순환 종양 세포 또는 CTC를 필요한 농도로 희석합니다. 다음으로, poly-lysine 코팅된 현미경 슬라이드와 세포 원심분리기 필터 카드를 세포 원심분리기 깔때기 어셈블리에 조립합니다. 세포 현탁액을 어셈블리의 깔때기 포트로 옮긴 후 세포 원심분리를 수행합니다.

원심력은 세포의 단층을 집중시켜 슬라이드의 원형 영역에 증착합니다. 실리콘 아이솔레이터를 사용하여 세포가 침착된 영역을 분리합니다. 건조되면 파라포름알데히드를 사용하여 세포를 고정합니다. 다음으로, 세포 표면의 비특이적 결합 부위에 쉽게 결합하는 단백질을 포함하는 적절한 차단 용액으로 세포를 배양합니다.

이제 관심 있는 형광 표지 항체 용액으로 세포에 레이블을 지정합니다. 형광단이 부착된 항체는 세포 표면의 특정 표적 분자를 인식하고 결합합니다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 샘플을 세척합니다. 이미징을 위해 샘플을 준비하기 위해 장착 용액을 추가합니다.

형광 현미경을 사용하여 CTC의 표적 항원에 결합된 항체-형광단 접합체에서 방출되는 빛을 검출합니다. 이 프로토콜에서는 비소세포폐암 환자 샘플에서 CTC의 면역형광 분석을 수행할 것입니다.

- 면역형광 염색의 경우, 혈구계에서 세포를 계수하고 농축 된 샘플을 0.2 % 항 결합 용액 농도의 100 마이크로 리터 당 5 번째 세포까지 1 배 10으로 희석합니다. 다음으로, 50마이크로리터의 결합 방지 용액을 적신 면봉을 사용하여 샘플 챔버의 윤곽을 적시고 샘플 챔버에 폴리 라이신 유리 슬라이드를 놓습니다.

챔버를 닫고 위아래로 세 번 피펫을 사용하여 마이크로피펫 팁에 결합 용액을 코팅한 후 샘플을 상층액의 마지막 100마이크로리터에 다시 현탁시킵니다. 세포 용액을 시료 챔버로 옮기고 전용 원심분리기에서 낮은 가속도로 4분 동안 4분 동안 분당 400회 회전하며 시료를 사이토스핀합니다.

원심분리가 끝나면 증착 영역 주위에 실리콘 절연체를 놓고 미생물 안전 캐비닛 아래에서 슬라이드를 2분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 사이토스핀 샘플을 실온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드 100마이크로리터로 고정한 다음 실온에서 세척당 200마이크로리터의 PBS로 2분 3회 세척합니다.

마지막 세척 후, 실온에서 차단 시약에서 30분 배양으로 비특이적 결합을 차단한 후 관심 항체 용액 100마이크로리터로 라벨링합니다. 라벨이 붙은 슬라이드를 100 x 15밀리리터 페트리 접시에 담아 2ml의 멸균수를 적신 흡수성 종이 조각에 놓고 접시를 밤새 섭씨 4도에서 닫아 빛으로부터 보호합니다.

다음날 아침, 시연된 대로 PBS로 샘플을 세 번 세척하고 10마이크로리터의 적절한 장착 용액과 유리 커버 슬립으로 샘플을 장착합니다. 그런 다음 투명 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하십시오.

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