Whole Lung Agarose Inflation: 생체 외 라이브 이미징을 위해 폐를 준비하는 방법

- 먼저 안락사된 쥐를 해부판에 놓습니다. 복부 바로 위에서 피부와 복막을 자릅니다. 횡격막에 구멍을 뚫고 갈비뼈와 흉곽을 따라 기관까지 자릅니다. 기관을 작게 절개합니다. 용골을 손상시키지 않고 기관 내부에 바늘을 부드럽게 삽입하고 집게로 고정합니다. 폐 내부에 정상 체온에서 저융점 아가로스를 주입합니다. 주사기를 천천히 제거하고 바늘을 내부에 두어 아가로스의 역류를 방지합니다.

아가로스 겔화를 촉진하기 위해 폐에 차가운 PBS를 붓습니다. 바늘을 제거하고 응고되지 않은 아가로스의 역류를 방지하기 위해 집게로 기관을 고정합니다. 흉골을 절개하고 집게로 기관을 잡고 가위로 자릅니다. 흉강에서 폐를 빼냅니다. 미디어에서 엽을 분리합니다. 현미경 검사를 위한 생리학적 조건에서 이미징 웰 내부에 배치합니다. 아가로스는 생리학적 온도에서 폐 형태를 보존하여 살아있는 세포 상호 작용을 관찰하는 데 도움이 됩니다. 다음 프로토콜에서는 암세포와 기질 세포 간의 상호 작용을 연구하기 위해 폐의 생체 외 라이브 이미징을 시연합니다.

- 생체 외 라이브 이미징을 위해 폐를 준비하려면 먼저 담금질 조각으로 덮인 폴리스티렌 폼 뚜껑에 마우스를 고정시키고 70% 에탄올로 동물을 살균합니다. 다음으로, 수술용 가위를 사용하여 피부를 가로 상복부 절개한 다음 복막을 통해 유사한 절개를 합니다. 그런 다음 해부판을 수직 위치로 옮기고 하행 대동맥을 잘라 혈액이 흉강이 아닌 복부로 고이

도록 합니다.

횡격막의 작은 구멍을 잘라 진공을 해제한 다음 흉곽을 따라 잘라 횡격막을 절제하고 폐를 시각화합니다. 수술용 가위를 사용하여 갈비뼈 위의 기관까지 피부를 자르고 갈비뼈는 그대로 둡니다. 그런 다음 흉곽에서 피부를 분리하고 주변 결합 조직을 제거하여 기관을 노출시키고 기관 자체가 손상되지 않도록 주의합니다. 기관을 완전히 자르지 않고 연골 고리와 평행하게 노출된 기관에서 직경 약 1mm의 작은 구멍을 후두에 최대한 가깝게 잘라냅니다.

그런 다음 반력 없이 20-4mm의 5게이지 바늘을 기관에 부드럽게 삽입합니다. 바늘 끝은 기관을 통해 볼 수 있어야 합니다. 주사기에 섭씨 37도 2% 낮은 용융 온도 아가로스 400마이크로리터를 채운 다음 집게로 바늘을 고정합니다. 해부 보드를 수직으로 유지하면서 바늘을 통해 따뜻한 아가로스의 전체 양을 폐에 천천히 주입합니다. 폐가 팽창하면 바늘을 기관 내부에 유지한 상태에서 주사기를 분리하고 폐에 섭씨 20도의