폐암종 세포의 3차원 배양: 세포-매트릭스 상호작용을 연구하는 방법

- 먼저, 기저막 매트릭스의 바이알을 섭씨 4도에서 밤새 해동합니다. 기저막 기질은 종양 미세환경에 존재하는 단백질로 구성되어 체외에서 암세포의 특성을 유지하는 데 도움이 됩니다. 다음 날, 기저막 매트릭스 바이알을 얼음 위에 올려 매트릭스를 액체 상태로 유지합니다. 폐암 세포를 예냉각된 원심분리기 튜브에 넣고 섭씨 4도에서 원심분리기를 합니다. 상층액을 흡입하고 부드럽게 두드려 펠릿을 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 이 튜브에 적절한 부피의 기저막 혼합물을 추가하고 혼합하여 균일한 세포 현탁액을 만듭니다. 기저막이 겔화되는 것을 방지하기 위해 저온에서 모든 단계를 수행하십시오.

적절한 부피의 세포 매트릭스 현탁액을 예냉각된 웰 플레이트의 각 웰 중앙으로 옮겨 전체 웰을 덮습니다. 매트릭스가 응고될 수 있도록 웰 플레이트를 배양합니다. 매트릭스 내 세포가 균일하게 분포되어 있는지 확인하기 위해 현미경으로 검사합니다. 각 웰에 3D 배양 완전 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 배양합니다. 이 배지는 세포 기질 상호 작용을 촉진합니다. 따라서 세포는 아시나르와 같은 구조를 가진 오가노이드를 형성합니다. 다음 프로토콜에서는 TUM622 폐암 세포의 3D 배양을 수행합니다.

먼저 섭씨 4도의 냉장고에서 지하 멤브레인 매트릭스의 바이알을 밤새 해동합니다. 2밀리리터 플라스틱 피펫과 팁을 영하 20도에서 밤새 식히십시오. 다음 날, TUM622 세포, HEPES 완충액, 트립신-EDTA 및 트립신 중화 완충액을 해리하는 데 사용되는 시약을 섭씨 37도의 수조에서 따뜻하게 합니다. 해동된 기저막 매트릭스를 냉장고에서 꺼내 바이알을 얼음 위에 올려 놓습니다. 얼음 위에 놓인 금속 플랫폼 쿨러에서 조직 배양 플레이트를 식힙니다. 얼음 위의 금속 냉각 랙에 원심분리기 튜브를 놓습니다. 웰의 수와 각 웰의 세포 농도를 기준으로 준비해야 하는 세포의 수를 계산합니다. TUM622 셀 현탁액을 냉각된 원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도의 행잉 버킷 원심분리기에서 5분 동안 300회 g으로 회전합니다.

여과되지 않은 팁에 흡인 피펫을 부착하여 상층액을 조심스럽게 흡인하여 튜브에 약 100마이크로리터의 배지를 남겨둡니다. 튜브 측면을 부드럽게 두드려 펠릿을 제거하고 연결한 다음 냉각 랙에 다시 넣습니다. 2ml의 예냉각된 피펫을 사용하여 위아래로 몇 차례 피펫팅하여 얼음 위에서 매트릭스를 부드럽게 혼합합니다. 이 과정에서 매트릭스에 기포가 유입되지 않도록 균일하고 적당한 속도로 피펫팅합니다.

매트릭스 1.1ml를 각 원심분리기 튜브에 넣습니다. 사전 냉각된 팁을 사용하여 각 튜브의 매트릭스를 약 10회 위아래로 피펫팅하여 균일한 세포 현탁액을 만듭니다. 310마이크로리터의 셀 매트릭스 현탁액을 예냉각된 24웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 피펫을 플레이트 표면에 90도 각도로 놓고 웰 중앙에 현탁액을 추가합니다. 현탁액은 퍼져 전체 우물을 덮습니다. 다운스트림 면역형광 분석을 용이하게 하려면 60마이크로리터의 세포 매트릭스 현탁액을 2웰 챔버 슬라이드의 웰 중앙으로 옮깁니다. 이를 통해 매트릭스는 훨씬 더 작은 부피를 가진 돔과 같은 구조를 형성할 수 있습니다.

플레이트와 챔버 슬라이드를 조직 배양 인큐베이터로 다시 넣고 매트릭스가 응고될 때까지 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 플레이트를 검사하고 광학 현미경 아래로 밀어 넣어 단일 세포가 매트릭스 내에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다. 플레이트의 각 웰에 1ml의 예열된 3D 배양 완전 배지를 추가하고 챔버 슬라이드의 각 웰에 1.5ml의 3D 배양 배지를 추가합니다. 그런 다음 인큐베이터로 다시 넣으십시오.