용량 증량 전 IC50 결정이 중요한 이유는 무엇입니까?

MTT 분석을 통해 기저 IC50을 설정하면 1/10 IC50에서 용량 증가를 시작하기 위한 기준 농도를 제공하며, 이를 통해 즉각적인 세포 독성 없이 선택적 압력이 가해지도록 합니다. 이는 급성 세포 사멸 대신 시간에 따른 점진적인 내성 발달을 가능하게 합니다.

MTT 분석 결과는 내성 발달에 대해 어떤 정보를 제공하나요?

MTT 분석은 생존 세포의 미토콘드리아 환원효소 활성에 의한 포르마잔 생성을 측정하며, 570 nm에서의 광밀도는 세포 수와 상관관계를 갖습니다. 초기에는 성장을 억제했던 afatinib 농도가 점차 증가함에도 세포가 생존력을 유지할 때 내성이 확인됩니다.

내성 세포주 개발의 신뢰할 수 있는 재현을 가능하게 하는 것은 무엇입니까?

아포화 전 단계(subconfluency)에서 계대 배양 시마다 농도를 10-20%씩 단계적으로 높이는 용량 증량법은, 여러 실험실에서 재현 가능한 표준화된 선택 압력 프로토콜을 제공하여 이소제닉(isogenic) 내성 모델을 생성할 수 있게 합니다.

교차 기능적 협업(cross-functional collaboration)에서 복제 요구사항이 필수적인 이유는 무엇입니까?

반복 실험 전반에 걸쳐 일관된 내성이 발달한다는 것은 관찰된 표현형이 무작위적인 것이 아니라 유전적으로 유도되었음을 보장하며, 이를 통해 타겟 검증 연구를 위한 발견, 분석법 개발 및 전임상 팀 간의 신뢰할 수 있는 인수인계가 가능해집니다.

내성 발현을 확인하기 위해 어떤 통계 분석이 필요한가요?

모세포와 용량 증량 세포 간의 MTT 분석 유래 생존율 곡선을 비교하여 내성을 확인하며, 시간 경과에 따른 약물 민감도 감소를 입증하기 위해 통계적 유의성 검정(예: IC50 이동 분석)이 필요합니다.

용량 증량: 암세포에서 약물 내성을 개발하는 방법

JoVE Encyclopedia of Experiments

암 연구

0 조회수 • 4:17 분 • April 30th, 2023

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- 티로신 키나아제 억제제(TKI)는 키나아제 수용체가 ATP에 결합하는 것을 차단하여 인산화를 방지합니다. 성장 배지에서 암세포를 도금하는 것으로 시작합니다. 유리한 밀도에 도달하고 세포를 여러 웰로 이동시킵니다. 하룻밤 동안 성장한 후 여러 웰에 다양한 약물 농도를 분배하고 원하는 기간 동안 세포가 성장하도록 합니다. 수용성 염료인 MTT를 첨가하여 세포 생존율을 측정합니다. 미토콘드리아 효소는 MTT를 살아있는 세포 내에서 불용성 자주색 포르마잔으로 변환합니다.

적절한 가용화제를 첨가하여 반응을 중지하고 포르마잔을 분광 광도계로 측정합니다. 이 방법을 MTT 분석이라고 합니다. 약물 농도에 대해 포르마잔으로 표시된 살아 있는 세포의 그래프를 플로팅합니다. 소프트웨어를 사용하여 세포의 50%를 죽이는 약물 농도를 찾아 억제 농도 IC₅₀을 계산합니다.

다음으로, 성장 배지에서 암세포를 성장시키고 세 개의 다른 플레이트에 분포시킵니다. 세포가 subconfluency에 도달한 후 IC₅₀ 농도의 1/10 희석을 추가합니다. 세포가 성장하도록 하고 MTT 분석을 수행합니다. 약물 복용량을 늘리면서 이 과정을 반복합니다. 암세포는 단백질 염기서열의 돌연변이로 인해 TKI에 대한 내성을 서서히 발달시킵니다.

다음 프로토콜은 용량 증량에 의한 PC9 세포의 아파티닙 내성 발달을 보여줍니다.

- 적절한 아파티닙 내성 농도를 결정하기 위해, 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 처리된 10cm 세포 배양 접시에서 성장 배지의 PC9 세포를 배양합니다. 성장 배지 농도의 밀리리터당 4 세포 농도를 4 곱하기 10 - 4 세포로 PC9 세포를 재현탁시키고 96 웰 마이크로플레이트에서 웰당 50 마이크로리터의 세포 현탁액으로 세포를 시딩합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 배양 후, 표시된 농도의 6회 반복에서 웰당 50마이크로리터의 파티닙 용액으로 세포를 처리합니다. 그리고 세포 배양 인큐베이터에서 96시간 배양 후 각 웰에 15마이크로리터의 MTT 염료를 추가합니다.

세포 배양 인큐베이터에서 4시간 후 각 웰에 100마이크로리터의 가용화 정지 용액을 추가하고 플레이트를 밤새 인큐베이터에 다시 넣습니다. 다음 날 아침, 마이크로플레이트 리더에서 570나노미터의 광학 밀도를 측정합니다. 지속적인 아파티닙 노출을 위해 세포가 저포화도에 도달할 때까지 10ml의 성장 배지가 포함된 P100 접시에서 PC9 세포를 배양합니다.

subconfluent 배양액을 초기 배양 접시당 9ml의 성장 배지로 구성된 3개의 새로운 P100 접시로 옮기고 세포를 세포 배양 incubator로 되돌립니다. 다음날 아침, 0.1 나노몰 또는 아파티닙의 절반 최대 억제 농도의 1/10을 3개의 배양 접시 각 세트에 추가합니다. 아파티닙 처리된 세포가 아합류 상태가 되면 1밀리리터 피펫을 사용하여 배양액을 철저히 혼합하고 각 접시에서 1밀리리터의 세포를 새 P100 접시에 있는 9밀리리터의 신선한 성장 배지로 옮깁니다.

새로운 배양액에 10%에서 20% 더 높은 농도의 아파티닙을 추가하고, 10-12개월 동안 배양액이 하위 포화에 도달할 때마다 단계적 용량 증량으로 아파티닙 농도를 증가시킵니다. 1마이크로몰의 아파티닙 농도에 도달하면 시연된 대로 MTT 분석을 수행하여 세포에 아파티닙 내성이 발생했는지 확인합니다.