0 조회수 • 5:38 분 • April 30th, 2023
- 먼저 조직 배양 배지가 들어있는 T-플라스크에 폐암 세포를 파종하고 하룻밤 동안 자라게 합니다. 다음으로, transfecting agent로 miRNA를 transfecting medium으로 현탁시킵니다. 배지를 제거하고 miRNA를 암세포에 도입하는 transfecting 배지를 추가합니다. miRNA는 상보적인 mRNA 염기서열에 결합하여 유전자 발현을 차단하는 비암호화 RNA 분자입니다. 원하는 기간 동안 플라스크를 배양합니다.
다음으로, 배지를 조직 배양 배지로 교체하고 하룻밤 동안 자랍니다. 세포 해리를 위해 트립신을 추가합니다. 혼합물을 PBS가 들어 있는 원심분리 튜브로 옮기고 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 용해 세포에 용해 완충액을 첨가하고 침전을 위해 초순수 에탄올을 첨가합니다. 혼합물을 분리 컬럼에 넣어 핵산과 원심분리기를 정제합니다.
흐름을 제거하고 세척 버퍼를 추가하여 용해된 세포막과 원심분리기를 제거합니다. 세척 버퍼를 제거하고 DNase 분해 버퍼와 함께 DNase를 추가하여 샘플과 원심분리기에서 DNA를 제거합니다. RNA 분취 완충액을 추가하여 RNA와 원심분리기를 분리합니다. 상층액에 존재하는 RNA를 수집합니다. 다음 프로토콜에서는 miRNA 처리된 폐암 세포에서 RNA 추출을 수행합니다.
- 먼저, qPCR 또는 마이크로어레이 분석을 사용하여 유전자 발현을 수행하기 위해 RNA 및 단백질 추출에 충분한 적절한 플라스크에 암세포를 파종합니다. 그런 다음 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 배지로 밤새 배양합니다.
다음 날, 배지에서 microRNA 143 및 microRNA 506을 각각 100나노몰의 농도로 희석하여 transfection을 위해 microRNA 샘플을 준비합니다. 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내고 미디어를 제거합니다. 1 x PBS로 세척하십시오.
처리되지 않은 모든 대조군에는 세포가 있는 불완전한 배지만 포함됩니다. incubator에서 6시간 동안 transfection media로 세포를 배양합니다. 6시간 후 미디어를 제거하고 4밀리리터의 새 전체 미디어로 교체합니다. 24시간 및 48시간 후에 트립신화(trypsinization)를 통해 세포를 수확합니다.
다음으로 각 튜브에 1x PBS로 두 번 세척하고 상층액을 제거합니다. 나중에 RNA 추출을 수행하려면 세포를 섭씨 영하 80도에서 동결하십시오.
- RNA 추출은 제조업체의 지침에 따라 RNA 키트를 사용하여 수행되었습니다. 먼저 섭씨 영하 80도에서 튜브를 제거하고 해동시킵니다.
- 300 마이크로 리터의 용해 완충액과 피펫을 위아래로 추가하여 세포막을 파괴합니다. 100% 초순수 에탄올을 동일한 부피로 첨가합니다. 그런 다음 잘 섞어 분리 컬럼에 놓습니다. 원심분리기를 사용하여 흐름을 제거합니다.
400마이크로리터의 세척 버퍼와 원심분리기를 추가하여 버퍼를 제거합니다. 각 샘플에 5마이크로리터의 DNAse I와 75마이크로리터의 DNA 분해 버퍼를 추가하고 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 400마이크로리터 RNA 분취 완충액으로 샘플을 세척합니다.
다음으로 RNA 세척 버퍼로 두 번 세척합니다. 이제 컬럼에 뉴클레아제가 없는 물을 추가하고 원심분리한 다음 RNA를 수집합니다. RNA 농도를 측정하면 이 단계에서 RNA 염기서열분석을 위해 2마이크로그램의 RNA 샘플을 보낼 수 있습니다.