0 조회수 • 3:34 분 • April 30th, 2023
- microRNA 또는 miRNA는 작은 비암호화 RNA입니다. mRNA는 transfection 또는 세포에 도입된 후 miRNA 단백질 복합체를 형성합니다. 이 복합체는 특정 mRNA를 표적으로 하고 결합하며 발현을 부정적으로 조절하여 세포주기 진행을 중단시킵니다.
분석을 시작하려면 miRNA 형질 주입된 폐암 세포의 수확된 배양액에 적절한 탈수 고정제를 추가합니다. 고정액은 세포를 보존하고 세포막을 투과화합니다. 세포를 프로피듐 요오드화물, 형광 핵산 염료, 리보뉴클레아제 효소의 혼합물로 처리합니다.
염료는 세포에 들어가 DNA와 RNA를 모두 염색합니다. 효소는 RNA를 특이적으로 분해하여 최적의 DNA 정량화를 가능하게 합니다. 유세포분석기를 사용하여 개별 세포 형광 강도에 따라 서로 다른 세포 주기 단계에서 중단된 세포의 비율을 확인할 수 있습니다.
휴지기 및 성장 단계의 세포는 DNA 함량이 낮기 때문에 형광 강도가 낮습니다. DNA의 양이 두 배인 Gap 2 단계의 세포는 두 배의 형광 강도를 생성합니다. DNA 합성 단계의 세포는 다른 두 집단 사이에 형광 값을 유도합니다. 다음 프로토콜은 PI 염색 및 유세포 분석을 사용하여 DNA 함량을 측정하여 miRNA 처리된 폐암 세포의 세포주기 조절을 분석합니다.
- 이 비디오의 앞 섹션에서 설명한 대로 세포를 transfection합니다. 트립신화를 통해 각 샘플의 세포를 별도의 15ml 멸균 튜브에서 수확합니다. 다음으로, 751g에서 5분간 원심분리하여 1X PBS로 세포를 2회 세척한 후 상층액을 제거합니다. 피펫팅을 통해 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 1X PBS를 첨가하여 펠릿을 재현탁하고 분해합니다.
2ml의 70% 얼음처럼 차가운 에탄올을 튜브에 적가하면서 튜브를 부드럽게 소용돌이쳐 세포를 고정합니다. 튜브를 실온에서 30분 동안 배양하고 섭씨 4도에서 1시간 동안 보관합니다. 섭씨 4도에서 튜브를 제거하고 원심분리하십시오.
얼음처럼 차가운 PBS 2mL와 볼텍스를 첨가한 후 원심분리로 상층액을 제거합니다. 각 샘플에 각각 밀리리터당 50 및 200 마이크로그램 농도의 프로피듐 요오드화물과 리보뉴클레아제 A를 함유한 1X PBS 500 마이크로리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 시료를 빛으로부터 보호하고 유세포 분석기에서 작동하는 적절한 튜브로 옮깁니다.
본 연구는 폐암 세포의 세포 주기 조절에서 마이크로RNA(miRNA)의 역할을 조사합니다. 유세포 분석법과 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide) 염색을 활용하여, miRNA 처리 세포의 DNA 함량을 정량화하고 세포 주기 단계를 분석하는 것을 목표로 합니다.
miRNA가 전이된 폐암 세포의 정량적 세포 주기 분석을 통해 종양학 약물 발견과 관련된 세포 주기 조절 기전을 정밀하게 조사할 수 있습니다. 유세포 분석 기반의 DNA 함량 측정은 초기 단계의 치료제 개발 프로그램에서 타겟 검증 및 기전적 리스크 감소를 위한 실행 가능한 데이터를 제공합니다. 이러한 접근 방식은 종양학 R&D 파이프라인의 주요 변곡점에서 예측 신뢰도를 높이는 데 기여합니다.
이 유세포 분석 기반의 세포 주기 분석은 발견 단계부터 전임상 단계까지의 연속 과정에 통합되어, 종양학 연구에서의 표적 검증과 리드 화합물 발굴을 모두 지원합니다.
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마지막 업데이트: 29 8월 2026