혈장 miRNA 분리를 위해 원심분리 온도가 중요한 이유는 무엇입니까?

4°C에서 원심분리를 수행하면 혈구의 세포 용해와 비특이적 miRNA 방출을 방지하여, 바이오마커 분석을 위한 시료의 무결성을 유지할 수 있습니다.

단백질 분해효소 K(proteinase K)는 추출 과정 중 miRNA를 어떻게 보호하나요?

Proteinase K는 후속 처리 과정 중 RNA를 분해할 수 있는 뉴클레아제를 포함한 단백질들을 분해하여 miRNA의 안정성을 보장합니다.

프로토콜에서 DNase 1 처리의 목적은 무엇입니까?

DNase 1은 샘플에서 게놈 DNA 오염을 제거하여, 후속 응용 단계의 miRNA 정제 특이성을 향상시킵니다.

혈장 수집 후 1시간 이내에 처리해야 하는 이유는 무엇입니까?

신속한 처리는 ex vivo 세포 변화와 miRNA 방출 또는 분해를 방지하여, 순환 바이오마커 프로파일의 충실도를 유지합니다.

추출된 miRNA의 무결성을 유지하기 위한 보관 조건은 무엇입니까?

용출된 miRNA를 -80°C에서 보관하면 RNA 분해를 방지하고 종단적 바이오마커 연구에 적합한 상태를 유지할 수 있습니다.

miRNA 추출: 혈장 샘플에서 miRNA를 추출하는 방법

JoVE Encyclopedia of Experiments

암 연구

0 조회수 • 3:59 분 • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- MicroRNA 또는 miRNA는 유전자 조절에 관여하는 작은 비암호화 RNA입니다. 이들의 발현은 암 중에 변화하므로 잠재적인 암 바이오마커입니다. miRNA 분리를 시작하려면 새로 채취한 전혈 샘플을 채취하고 섭씨 4도에서 원심분리하여 혈액 세포에서 혈장을 분리합니다. 상층액을 새 튜브로 옮기고 다시 원심분리기를 사용하여 더 깨끗한 플라즈마 상층액을 얻습니다. 상등액을 추출하고 냉각된 균질화 용액으로 처리한 다음 용해 완충액을 사용하여 샘플을 균질화합니다. proteinase K 효소 용액을 추가하여 단백질, 특히 다운스트림 단계에서 RNA를 소화할 수 있는 nuclease를 분해합니다.

- 다음으로, 사전 조립된 기기 특정 핵산 추출기 카트리지의 지정된 웰에 용해물을 로드합니다. DNase 1 용액을 적절한 웰에 첨가하여 샘플에서 게놈 DNA를 제거합니다. miRNA 분리 전에 컨디셔닝을 위해 카트리지에 조립된 용출 튜브에 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다. 카트리지 어셈블리를 핵산 추출기에 로드합니다. 적절한 miRNA 정제 소프트웨어를 선택하고 실행합니다. 완료되면 miRNA가 포함된 용출 튜브를 제거하고 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

- 다음 프로토콜에서는 폐암 검진을 위해 환자의 혈액 샘플에서 miRNA를 추출하는 방법을 보여줍니다.

- 이 프로토콜을 시작하려면 액포 튜브를 사용하여 10ml의 전혈 샘플을 수집합니다. 실온에서 보관하십시오.

- 비특이적 microRNA 방출로 이어지는 열 충격과 세포 용해를 방지하기 위해 전혈을 섭씨 4도와 같은 저온에서 보관하지 마십시오.

- 1시간 이내에 플라즈마를 원심분리하여 분리합니다. 림프구 고리와의 접촉을 피하면서 상층액을 15ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 동일한 조건에서 상등액을 원심 분리하십시오. 이 플라즈마 상등액 1ml를 1.5mm cryovials로 분취하되, 튜브 바닥에서 혈장 분획을 수집하지 않도록 주의하십시오. RNA 분리를 시작하려면 각 샘플에 대해 200마이크로리터의 플라즈마에 200마이크로리터의 사전 냉각 OMG 용액을 추가합니다. 완전한 균질화를 위해 15-30초 동안 소용돌이치십시오. 샘플을 균질화하려면 샘플당 200마이크로리터의 용해 완충액과 25마이크로리터의 단백질 분해 효소 K를 추가하고 20초 동안 와류를 사용합니다.

- 그런 다음 섭씨 37도의 써모믹서에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 다음으로, RSC miRNA tissue method를 선택하고 핵산 자동 추출기의 데크 트레이에 각 샘플에 대한 카트리지를 로드하고 플런저를 올바르게 배치합니다. 용해물을 옮기고 5마이크로리터의 DNase 1 용액을 기기 카트리지의 적절한 위치에 추가합니다. 각 용출 튜브의 바닥에 60마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 추가합니다. 자동 정제를 시작하려면 실행을 시작합니다. 총 RNA 샘플은 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.