엑소좀 분리: 비소세포폐암 환자의 혈장에서 엑소좀을 분리하는 기법

- 엑소좀은 지질, 단백질, DNA, mRNA, microRNA와 같은 생체 분자를 운반하는 막으로 둘러싸인 작은 소포입니다. 엑소좀은 다양한 세포 유형에 의해 세포 외 공간으로 방출되며 혈장과 같은 생체 유체에서 분리될 수 있습니다.

먼저 혈장 샘플을 원심분리하여 세포와 파편을 제거합니다. 플라즈마 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 원하는 농도의 리보뉴클레아제 효소로 혈장을 처리합니다. 적절한 시간 동안 섭씨 37도의 가열 블록에서 샘플을 배양합니다.

이 효소는 샘플의 모든 유리 RNA를 분해하는 반면, 엑소좀 RNA는 보호된 상태로 유지됩니다. PBS를 사용하여 샘플을 희석합니다. 다음으로, 원하는 농도의 Proteinase K 효소 용액을 첨가하고 적절한 시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. Proteinase K는 대량의 혈장 단백질을 분해합니다. 또한 이전에 첨가된 리보뉴클레아제 효소를 비활성화하여 다운스트림 공정 중 엑소좀 RNA 분해 위험을 제거합니다.

혈장에서 엑소좀 분리를 용이하게 하기 위해 적절한 양의 엑소좀 침전 완충액을 추가합니다. 샘플을 원심분리하여 온전한 엑소좀이 들어 있는 펠릿을 얻습니다. 분리된 엑소좀은 RNA 및 단백질 추출과 같은 다운스트림 단계에서 응용됩니다.

다음 프로토콜에서는 비소세포폐암 환자의 혈장 검체에서 엑소좀 분리를 수행합니다.

- 먼저 1ml의 혈장 샘플을 얼음에서 해동합니다. 일단 해동되면 튜브를 여러 번 뒤집어 형성되었을 수 있는 동결침전물을 분해합니다. 그런 다음 실온에서 20분 동안 2,000Gs의 플라즈마를 원심분리하여 세포와 파편을 제거합니다. 상층액을 수집하고 플라즈마를 다시 원심분리하여 10,000Gs에서 20분 동안 사용합니다. 다시 혈장 상층액을 수집하고 이제 10마이크로리터의 RNAse를 추가합니다. 섭씨 37도의 플라즈마를 열 블록 히터에서 10분 동안 배양합니다.

- free microRNA를 분해하기 위해 표준 키트 프로토콜에 RNAse 처리 단계를 추가했습니다. 나중에, RNAse를 분해하고 엑소좀 microRNAs의 무결성을 보호하기 위해 kit 프로토콜에 포함된 proteinase K 처리 단계를 활용했습니다.

- 다음으로, 플라즈마를 1x PBS의 절반 부피로 새 튜브로 옮기고 볼텍스합니다. 그런 다음 0.05 부피의 proteinase K 용액을 추가하고 샘플을 다시 와류로 처리한 다음 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 이제 0.2 부피의 엑소좀 침전 버퍼를 추가하고 inversion으로 샘플을 혼합합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다.

저온 배양 후 실온에서 5분 동안 10,000Gs로 샘플을 원심분리합니다. 20-50 마이크로리터의 상등액 분취액을 취하여 제어 목적으로 보관하십시오. 그런 다음 흡입하고 남은 상층액을 버립니다.

엑소좀 펠릿을 선택한 완충액에 downstream 분석에 따라 부피로 재현탁합니다. RNA 분석의 경우 RNA 추출을 위한 특정 용해 버퍼를 추가합니다.