3D DNA 물고기: 염색체에서 특정 유전자를 찾는 기술

- 표면에 세포가 부착되어 있고 면역 형광 염색으로 염색된 기능화된 와이어를 사용합니다. 얼음, 차가운 식염수, 구연산나트륨 또는 SSC 용액으로 씻으십시오. 형광 태그가 지정된 프로브가 들어 있는 마이크로튜브에 와이어를 넣고 와이어 스토퍼로 닫습니다. 세포 내 DNA를 변성시키기 위해 섭씨 75도의 혼성화 오븐에서 어둡고 습한 챔버에서 마이크로튜브를 배양합니다.

프로브가 DNA의 상보 서열에 결합할 수 있도록 챔버를 섭씨 37도의 오븐으로 옮깁니다. 그런 다음 오븐에서 챔버를 제거하고 와이어를 꺼냅니다. 원하는 온도에서 SSC 용액이 들어 있는 튜브에 와이어를 담그십시오. Tween이 포함된 SSC 용액으로 와이어를 세척하여 비특이적 또는 부분적으로 하이브리드화된 프로브를 제거하고 증류수로 다시 세척합니다.

와이어를 건조시키고 기능화된 팁을 DAPI 용액에서 배양하여 세포핵을 염색합니다. 와이어를 PBS로 헹구고 자연 건조하십시오. 형광 현미경 아래에 와이어를 놓습니다. 관심 유전자와 교잡된 프로브는 세포핵에서 형광 반점으로 나타납니다. 다음 프로토콜에서는 폐암 세포에서 ALK 유전자의 전좌를 결정하기 위해 3D DNA FISH를 수행할 것입니다.

- DNA FISH 프로토콜 3시간 전에 혼성화 오븐을 섭씨 75도로 설정하고 건열 오븐을 섭씨 37도로 설정합니다. 0.4배 SSC 용액을 섭씨 4도로 냉각합니다. 얼음처럼 차가운 0.4배 SSC 용액으로 와이어를 세 번 세척합니다. 흄 후드 찬장 아래의 어두운 곳에서 10분 동안 와이어를 말리십시오.

10분 후 5초 동안 프로브를 소용돌이치고 회전시킵니다. 프로브 10마이크로리터를 유리 마이크로튜브에 떨어뜨린 다음 실험실 필름으로 덮습니다. 50ml 튜브에 넣은 흡수력이 좋은 마른 종이로 마이크로튜브를 싸서 짧게 돌립니다. 건조된 와이어를 마이크로튜브에 조심스럽게 넣고 와이어 스토퍼를 삽입합니다. 그런 다음 고무 시멘트로 와이어 스토퍼를 밀봉합니다.

완전한 DNA 변성을 얻기 위해 섭씨 75도에서 8분 동안 혼성화 오븐의 어둡고 습한 챔버에 와이어를 놓습니다. 8분 후, 습한 챔버를 섭씨 37도의 건조 가열 오븐으로 밤새 옮깁니다. 0.4배 SSC 용액이 든 슬라이드 염색 용기를 섭씨 72도로 설정된 수조에 넣습니다. 섭씨 72도 또는 영하 1도에 도달할 때까지 0.4배 SSC 용액 온도를 확인하십시오.

다음으로, 두 개의 유리 비커를 준비합니다 - 하나는 2 중 SSC와 0.05 % 트윈 용액이 들어 있고 다른 하나는 증류수가 들어 있습니다. 건열 오븐에서 습한 챔버를 제거하십시오. 핀셋을 사용하여 와이어 스토퍼에서 고무 시멘트를 조심스럽게 제거하고 기능화된 팁이 손상되지 않도록 주의하면서 코팅되지 않은 와이어 끝을 엔드 스토퍼를 통해 당깁니다.

와이어를 섭씨 72도에서 2분 동안 0.4중 SSC 용액에 담그십시오. 실온에서 30초 동안 2중 SSC와 0.05% 트윈 용액으로 와이어를 세척합니다. 그런 다음 실온의 증류수로 와이어를 세척하십시오. 어둠 속에서 10분 동안 흄 후드 아래의 와이어를 말리십시오. 2 밀리리터 바이알에 미리 준비된 DAPI 용액으로 와이어의 기능화된 팁을 배양합니다. 1중 PBS에서 와이어를 두 번 헹구고 와이어를 자연 건조합니다.

와이어 홀더에 와이어를 배치하고 팁이 커플링 포인트와 일치할 때까지 특수 홀더의 진입점을 통해 기능화된 팁을 조심스럽게 삽입합니다. 현미경 스테이지에 특수 홀더를 놓습니다. 20배 렌즈를 사용하여 현미경의 초점을 조정합니다. 먼저 특수 지지대에 거칠게 초점을 맞춘 다음 DAPI 채널에서 밝게 보이는 셀을 미세하게 조정합니다.