0 조회수 • 3:22 분 • April 30th, 2023
- 시작하려면 갓 준비된 배양 배지에 인간 백혈병 세포를 파종하고 원하는 기간 동안 배양합니다. 배양 후 이 세포 현탁액을 소량 트리판 블루로 염색하고 TC20 세포 카운터 슬라이드를 사용하여 세포 생존율을 평가합니다. 죽은 세포는 투과성이 있고 음전하를 띤 염료를 흡수하는 반면, 생존 세포는 투과성이 없습니다.
다음으로, 메틸 베타 사이클로덱스트린을 배양 플라스크에 첨가하여 세포의 콜레스테롤을 충분히 고갈시켜 초음파에 취약하게 만듭니다. 원하는 기간 동안 세포를 배양합니다. 세포 초음파 처리 시스템에 탈이온수를 채우고 진공 기포를 피하기 위해 몇 분 동안 가스를 제거합니다. 섬광 바이알에 원하는 양의 세포를 옮기고 바이알을 세포 초음파 처리 시스템의 고정 장치에 부착합니다.
혼 위에 고정 장치를 놓고 혼 상단에서 원하는 높이를 설정합니다. 세포를 초음파 처리하기 위해 원하는 기간 동안 필요한 펄스를 설정합니다. 세포 현탁액에 트리판 블루를 추가하고 TC20 세포 계수기에 배치하여 세포 생존력과 손상을 분석합니다. 메틸 베타 시클로덱스트린으로 처리된 백혈병 세포는 저주파 초음파에 노출될 때 상당한 세포 용해를 보입니다.
다음 프로토콜에서는 인간 백혈병 세포의 세포 초음파 처리 및 손상 평가를 연구합니다.
- 초음파 처리를 위해 세포를 준비하려면 먼저 새로 준비된 배지를 사용하여 25 평방 센티미터 플라스크에 밀리리터 당 4 번째 세포에 4 배 10으로 파종합니다. 트리판 블루 배제(trypan blue exclusion)로 생존 가능한 세포의 수를 결정한 후, 배양액이 원하는 농도에 도달할 때까지 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 배양합니다. 세포가 초음파 처리 준비가되면 진공 청소기와 Buchner 플라스크를 사용하여 이온화 된 증류수의 부피를 가스를 제거합니다. 그런 다음 물을 사용하여 컵 혼을 혼 상단에서 최대 15mm까지 채웁니다.
가스가 제거된 물로 시스템을 약 7분 동안 작동한 다음 3ml의 셀을 유리 20ml 섬광 바이알에 넣고 바이알을 고정 장치에 부착합니다. 그런 다음 고정 장치를 컵 혼 상단에 부착하고 슬라이딩 메커니즘을 사용하여 고정 장치를 수면의 혼 상단에서 15mm 높이로 설정합니다. 이제 33 % 및 50 % 진폭에서 각 펄스 사이에 1 초 간격으로 3 개의 1 초 초음파 펄스를 사용하여 세포를 초음파 처리합니다.
trypan blue exclusion에 의한 초음파 처리 후 세포 생존율을 평가합니다. 세포 손상을 평가하려면 Z2 입자 분석기의 조리개를 등장성 식염수로 최소 2회 세척합니다. 다음으로, 100 마이크로 리터의 초음파 처리 된 세포를 20 밀리리터의 등장 식염수에 넣고 세포 샘플을 카운터 홀더로 옮깁니다. 그런 다음 플랫폼을 조리개까지 올리고 제조업체의 지침에 따라 세포 손상, 생존력 및 파편을 분석합니다.