JoVE 실험 백과사전
암 연구
0 조회수 • 3:20 분 • April 30th, 2023
- 저주파 초음파는 인간 백혈병 세포의 선택적 용해로 이어지며 XTT 분석은 이러한 손상의 정도를 결정하는 데 도움이 됩니다. 이 분석은 건강한 세포의 미토콘드리아 효소가 노란색 XTT 염료를 포르마잔이라는 주황색 화합물로 변환한다는 원리에 따라 작동합니다. 분석을 시작하려면 콜레스테롤 파괴제인 메틸 베타-사이클로덱스트린으로 세포를 처리한 다음 세포를 저전력으로 초음파 처리하여 세포 손상을 유도합니다.
세포를 펠릿화하고 펠릿에 새로운 세포 성장 배지를 추가하는 원심분리기. 원하는 농도의 세포를 멀티웰 마이크로플레이트에 파종하고 밤새 배양합니다. 이제 활성화된 XTT 용액을 세포에 추가하고 마이크로플레이트의 웰에서 주황색이 나타날 때까지 배양합니다. 분광 광도계에 플레이트를 놓습니다. 450-500나노미터에서 흡광도를 측정한 다음 630-690나노미터에서 측정합니다. 정확한 결과를 얻으려면 두 값을 뺍니다. XTT 분석에서 흡광도 값이 높을수록 미토콘드리아 효소의 활성이 높고 세포 생존율이 높다는 것을 나타냅니다.
다음 비디오에서는 메틸 베타 시클로덱스트린 처리된 백혈병 세포에서 세포 손상을 일으키는 저주파 초음파의 효능을 결정하기 위해 XTT 분석을 사용하는 방법을 보여줍니다.
- XTT 분석에 의한 초음파 처리 된 세포의 생존 능력을 평가하기 위해 1 초 간격을 기준으로 1-3 개의 1 초 펄스 범위를 사용하여 세포를 초음파 처리하여 XTT 키트가 평가할 손상 범위를 개발합니다. 그런 다음 세포를 스핀 다운하고 펠릿을 갓 준비된 성장 배지에서 밀리리터당 5번째 세포에 1 곱하기 10으로 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 블랭크 흡광도 판독을 위해 100마이크로리터의 완전한 성장 배지만 포함하는 3개의 제어 웰을 포함하여 웰당 100마이크로리터의 세포를 개별 평평한 바닥 96웰 마이크로타이터 플레이트에 3회씩 시딩합니다. 세포를 24시간 동안 배양합니다.
분석 당일 아침에 섭씨 37도로 가열된 XTT와 활성화 시약의 부분 표본을 용액이 투명해질 때까지 부드럽게 소용돌이칩니다. 그런 다음 0.1ml의 활성화 시약을 XTT 시약의 5ml 부분 표본에 추가합니다. 다음으로, U937 및 THP1 접종 플레이트의 각 웰에 활성화된 XTT 용액 50마이크로리터를 추가하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 2시간 후 플레이트를 부드럽게 흔들어 양극 웰에 주황색 염료가 고르게 분포되도록 하고 450-500나노미터 사이의 마이크로타이터 플레이트 리더에서 흡광도를 측정합니다. 마지막으로, 630 및 690 나노 미터 사이의 모든 분석 웰의 흡광도를 다시 측정합니다.