0 조회수 • 3:24 분 • April 30th, 2023
- 브로모데옥시우리딘 또는 BrdU는 합성 티미딘 뉴클레오시드 유사체입니다. 세포주기의 합성 단계에서 BrdU는 티미딘을 대체하고 새로 합성된 DNA에 통합됩니다. 통합된 BrdU를 통해 세포 주기 진행을 추적할 수 있습니다. 통합된 BrdU를 검출하려면 먼저 세포를 고정하고 투과화하여 투과성으로 만듭니다.
다음으로, DNAse 효소로 세포를 처리하여 DNA 가닥을 절단하고 통합된 BrdU를 노출시킵니다. 그 후, 적절한 형광 표지된 항-BrdU 항체를 첨가합니다. 항체는 핵으로 들어가 DNA에 존재하는 노출된 BrdU에 쉽게 결합합니다.
또한 적절한 형광 DNA 결합 염료로 세포를 처리합니다. 염료는 DNA에 결합하여 전체 DNA 함량을 정량화할 수 있습니다. 유세포 분석을 사용하여 라벨링된 BrdU 및 DNA에서 형광을 검출할 수 있습니다.
표지된 DNA의 형광 강도는 총 DNA 함량의 변화에 따라 서로 다른 세포 주기 단계에서 세포를 분화합니다. BrdU의 형광 신호는 BrdU에 통합된 세포의 현재 세포주기 위치를 식별합니다.
이 예에서는 급성 림프구 백혈병 세포인 NALM-6의 BrdU 면역형광 염색을 수행합니다.
- 항체 염색 전에 세포를 DNAse로 처리하십시오. 100마이크로리터의 DNAse 용액에 세포를 재현탁시키고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 세척 완충액 1ml를 추가하고 세포를 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. BrdU 이외의 세포 내 마커에 대한 항체 염색은 BrdU 염색과 동시에 수행할 수 있습니다.
- 염색되지 않은 세포와 각 단일 형광 색소로 표지된 세포로 구성된 보상 대조군을 준비하는 것이 중요합니다. 이상적으로는 실험 튜브에 사용된 것과 동일한 항체를 보상 제어에 사용하는 것이 좋습니다.
- 50 마이크로 리터의 세척 버퍼에 10 당 1 마이크로 리터의 세포를 BrdU 항체의 6 세포에 재현탁시킵니다. 다른 특정 세포 내 항원에 대한 항체를 사용하는 경우 이 시점에서 추가해야 합니다. 실온에서 20분 동안 세포를 배양합니다.
20분 후, 앞서 그림과 같이 1ml의 세척 버퍼로 세포를 세척합니다. 마지막으로 세포주기 분석을 위해 DNA를 염색합니다. 튜브를 튕겨 펠릿을 풀고 20-AAD 용액 7마이크로리터를 추가합니다. 셀당 일정한 양의 7-AAD를 사용하는 것이 중요합니다. 1ml의 염색 완충액에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 유세포 분석을 수행합니다.