비교적 생체내에 학습 Xenopus laevis

이 절차의 전반적인 목적은 개구리 Xenopus laevis에서 열충격 단백질 GP96이 항원 특이적 CD8 T 세포 반응을 촉진하는 진화적 보존 능력을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 복강 세척을 통해 복강 백혈구를 수집함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 배양 및 세척 후, 마이너 항원과 종양 항원을 샤페론하는 종양 유래 GP96을 복강 백혈구에 펄싱하는 것입니다.

종양 또는 부종양 조직 적합성 항원에 대해 개구리를 감작시키기 위해, 복강 백혈구를 나이브 개구리에 복강 내 주입하여 입양 전이시킵니다. 절차의 세 번째 단계는 감작된 개구리에 피부 이식을 하거나 종양을 접종한 후, 피부 이식편의 거부 반응 또는 종양의 발현 여부를 관찰하는 것입니다. 마지막 단계는 말초혈을 채취하여 피부 거부 반응 및 항종양 반응에 관여하는 T 세포의 특성을 분석하는 것입니다.

최종적으로, 피부 이식 및 종양 유도 분석을 통해 각각 GP 96가 프라이밍된 개구리에서 피부 이식 거부 반응의 유의미한 가속화와 종양 발생의 지연을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 로체스터 대학교 의료 센터 미생물학 및 면역학과의 Dr. Jacque Robert 연구실의 Christina Koska입니다. 저는 마찬가지로 Dr. River의 연구실 소속인 Tanya Cruz입니다.

오늘은 복막 백혈구의 입양 전이를 통해 클론 개구리를 프라이밍하고, 이어서 피부 이식 및 종양 이식 분석을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다. 또한, 이 동물들로부터 말초혈액을 채취하는 방법도 함께 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 열충격 단백질 GP 96이 Xenopus laevis에서 항원 특이적 CD4+ T 세포를 촉진하는 능력과 이에 관여하는 세포 유형을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작하겠습니다. 본 실험에 사용된 개구리는 로체스터 대학교의 번식 군락에서 얻은 ISO 유전적 클론입니다. 수확을 위한 복강 백혈구(pls)를 유도하기 위해, 25게이지 5/8 바늘을 사용하여 마취된 개구리의 복강 내에 열처리 사멸시킨 e coli 제제를 주입합니다. 주입 3일 후, 복강 세척을 통해 pls를 수확합니다.

이 절차를 시작하려면, 마취된 개구리의 복부를 소량의 70% ethanol로 소독하십시오. 그런 다음 18 gauge 1.5 바늘을 사용하여 멸균된 양서류 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 실온으로 예열된 PBS 5 mL를 복강 내에 주입하십시오. 바늘을 제거하고 개구리를 1분 동안 부드럽게 마사지하여 주입된 완충액이 체강 내의 액체와 충분히 섞이도록 하십시오.

다음으로, 시린지가 장착되지 않은 새로운 18 gauge 1.5 바늘을 개구리의 복부에 삽입합니다. 혈관을 피하면서 바늘 뒷부분에서 떨어지는 복강액을 깨끗한 50 milliliter 원심 분리 튜브(conical tube)에 수집합니다. pls를 채취한 후, 처음에 주입했던 부피를 최대한 많이 회수하십시오.

개구리가 깰 때까지 얕은 물이 담긴 용기에 넣어둔 다음, 잠에서 깨어나면 다시 케이지로 옮깁니다. pls를 수확한 후, 4°C에서 1000 RPM으로 10분간 원심분리하고, sup, natant 및 resus를 제거합니다. pls를 차가운 A PBS에 현탁합니다.

재현탁된 pls를 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. PLS를 GP 96으로 펄싱하기 위해, 적절한 양의 GP 96을 pls에 첨가하고 피펫팅하여 혼합합니다. 얼음 위에서 1시간 동안 배양하십시오.

세포를 14,000 RPM에서 1분 동안 원심 분리합니다. 결합되지 않은 GP 96을 제거하기 위해 상층액을 제거합니다. 차가운 A PBS를 첨가하고 재현탁합니다.

PLS 원심분리를 다시 수행합니다. 최종 세척 후 잔류 G 96이 남지 않도록 차가운 A-P-B-S-A로 S를 총 3회 세척합니다. 나이브 LG 6 수용체로 PLS를 입양 전이시키기 위해, 300 µL의 PBS당 5 × 10⁵ PLS 농도로 펄스 처리된 PLS를 다시 현탁합니다.

동물당 300 µL의 pulsed pls를 복강 내로 주입합니다. 개구리는 다음에 설명할 피부 이식 또는 종양 유발 실험 전 최소 3일 전에 프라이밍되어야 합니다. 이식용 피부는 마취된 LG 15 공여 개구리로부터 얻습니다.

가위로 은색으로 보이는 복부 피부인 복측 피부의 작은 조각을 잘라내어 제거합니다. 이식편을 다룰 때 ARI로 인해 4개의 색소 세포가 나타납니다. 조직 조작을 최소화하는 것이 매우 중요한데, 이는 과도한 조작이 이식편 손상을 유발할 수 있기 때문입니다.

포셉으로 피부를 매우 조심스럽게 잡고 차가운 A PBS가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 페트리 접시를 계속 유지하십시오. 피부를 깨끗한 유리 슬라이드 위에 놓고 면도날을 사용하여 개별 이식편을 5 mm x 5 mm 크기로 자릅니다.

피부 조각을 LG six 수용체 개구리의 피부에 이식하기 위해 얼음 위의 PBS에 보관하십시오. 먼저, 마취된 수용체의 등쪽 피부에 작은 절개를 만듭니다. 그런 다음 5 mm x 5 mm 크기의 이식편을 은색 면이 위로 향하게 하여 피부 아래로 삽입하십시오.

가위와 포셉으로 표시한 부분은 이식편 거부 반응으로 간주되지 않으므로 반드시 이를 기록해 두십시오. 24시간 후 채점을 시작할 때, 이식편을 덮고 있는 숙주 피부의 일부를 제거해야 합니다. 가위를 사용하여 이식편 주변에 창을 내어 이식편이 충분히 보일 수 있도록 합니다.

공여부 피부를 건드리거나 출혈을 유발하지 않도록 주의하십시오. 즉시 스케치를 그려 이식 부위의 표시를 시작하십시오. 피부 이식.

거부 반응은 이식된 피부의 aridol 파괴 비율로 결정됩니다. 2~3일마다 실체 현미경으로 이식편을 확인해야 합니다. 300 µL당 5×10⁵ cells의 밀도로 종양 배양 배지에 현탁하여 이식용 종양 세포를 준비하십시오.

동물의 등 쪽 한 곳에 피하 주사를 통해 세포를 이식합니다. 개구리 한 마리당 300 µL 부피에 5 × 10⁵개의 세포를 주입합니다. 종양 유발 후 2~3주 이내에 종양 성장이 시작됩니다.

초기 종양의 외관을 관찰하십시오. 캘리퍼를 사용하여 종양의 크기를 측정하고, 개구리로부터 혈액 백혈구를 수집하기 전까지 2~3일마다 종양의 부피를 기록하십시오. 파스퇴르 피펫을 불꽃 위에서 당겨 유리 니들을 준비하십시오.

실체 현미경 하에서 피펫의 끝부분을 날카롭게 다듬은 후, 피펫을 흡입용 플라스틱 튜브에 연결합니다. 혈액 채취를 시작하려면 마취된 개구리의 뒷발 위쪽 피부를 절개하여 등쪽 족근정맥을 노출시킵니다. 유리 바늘에 1~2 mL의 ice cold PBS 및 헤파린 용액을 채웁니다.

그 다음 유리 바늘을 정맥에 삽입하고 입으로 천천히 흡입하여 혈액을 수집하기 시작합니다. 평균 크기의 개구리 한 마리에서 1~2 mL의 혈액을 얻을 수 있습니다. 개구리 다리에 낸 작은 절개 부위는 봉합할 필요가 없습니다.

상처는 일주일 이내에 치유될 것입니다. 이식 후 12일째에 실시한 피부 이식 거부 반응의 입체 현미경 분석 결과가 여기에 제시되어 있습니다. MHC가 동일한 LG six 공여체로부터 피부 이식을 받은 LG six 클론 개구리는 거부 반응을 보이지 않았습니다.

별표는 거부 반응으로 인한 것이 아닌 마커 포셉을 나타냅니다. 이와 대조적으로, MHC가 일치하지 않는 외교배 공여체로부터 피부 이식을 받은 LG six 클론 개구리는 80%의 거부 반응을 보입니다. 두 이미지 모두에서 화살표는 건강하고 거부 반응이 없는 이식 조직을 표시하는 은색 홍채의 4가지 색소 세포를 나타냅니다.

다음 실험에서는 LG 15 개체에 음성 대조군인 PBS, e coli 배양액에서 정제한 재조합 GP 96, 또는 15 zero 종양 조직 세포에서 정제한 GP 96을 펄스 처리하였습니다. 이후 이를 LG 15 성체 수혜 개체에 입양 전이하였으며, 3일 후 15 zero 종양 세포를 피하 주사로 이식하였습니다. 챌린지 후 종양이 처음 나타난 날짜를 모니터링하고 종양 크기를 주기적으로 측정하였습니다. 이 그래프에서 각 곡선은 개별 개구리의 종양 성장 역학을 나타냅니다. 결과에 따르면, 0.5 µg 또는 1 µg의 GP 96으로 프라이밍된 동물은 대조군에 비해 종양 발생이 유의하게 지연되었습니다. 따라서 GP 96은 xenopus에서 종양 항원의 교차 제시를 촉진합니다.

지금까지 피부 이식 및 종양 이식 분석을 통해 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)에서 GP 96이 소수 항원과 종양 항원을 모두 제시하는 능력을 탐색하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 혈관이 손상된 경우 복강 세척액을 수집하지 않도록 주의하는 것이 중요한데, 이는 세포의 대부분이 대식세포가 아닌 적혈구이기 때문입니다. 또한, 피부 이식물을 다룰 때 조직 손상을 방지하기 위해 핀셋으로 조직을 세게 쥐지 않는 것이 중요합니다.

이상입니다. 세척해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.