비교적 생체내에 학습 Xenopus laevis

이 절차의 전반적인 목표는 개구리 xenopus 소매에서 항원 특이적 CD 8 T 세포 반응을 촉진하는 열 충격 단백질 G 96의 진화적 보존 능력을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 복막 세척으로 복막 백혈구를 수확하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 배양 및 세척 후 미량 항원 및 종양 항원을 샤프론하는 종양 유래 GP 96으로 복막 백혈구를 펄스

복막 백혈구는 종양 또는 경미한 조직적합성 항원에 대항하여 이 개구리를 프라이밍하기 위해 복강내 주사에 의해 순진한 개구리로 채택적으로 전달됩니다. 절차의 세 번째 단계는 피부 이식 또는 종양이 프라이밍된 개구리에 도전하고 피부 이식, 거부 반응 또는 종양 출현의 시작을 모니터링하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 피부 거부 반응 및 항종양 반응에 관여하는 T 세포를 특성화하기 위한 말초 혈액을 얻는 것입니다.

궁극적으로, 피부 이식 및 종양 챌린지 분석을 통해 각각 피부 이식 거부 반응의 현저한 가속화와 GP 96 프라이밍 개구리의 종양 출현 지연을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 로체스터 대학 메디컬 센터 미생물학 및 면역학과의 자크 로베르 박사 연구실의 크리스티나 코스카입니다. 저는 Dr.River의 연구실에서 온 Tanya Cruz입니다.

오늘 우리는 복막 백혈구의 입양 이식으로 클론 개구리를 프라이밍하는 절차를 보여드리고, 그 후 피부 이식 및 종양 이식 분석을 보여 드리겠습니다. 또한 이 동물로부터 말초 혈액을 얻는 방법도 보여줄 것이다. 우리는 이 절차를 사용하여 단백질 GP 96을 가열하여 Salla에서 항원 특이적 CDAT 세포를 촉진하는 능력을 연구하고 관련된 세포 유형을 연구합니다.

자, 그럼 시작하겠습니다. 우리 실험에 사용된 개구리는 로체스터 대학의 번식 식민지에서 온 ISO 유전자 클론입니다. 수확을 위해 복막 백혈구 또는 pls를 유도하려면 25 게이지 5 8 바늘을 사용하여 마취 된 개구리에 열을 죽인 대장균 제제를 주입하십시오 주입 후 3 일 pls는 복강 내 세척으로 수확됩니다.

이 절차를 시작하려면 소량의 70% 에탄올로 마취된 개구리의 복부를 소독하십시오. 그런 다음 18 게이지 1.5 바늘을 사용하여 5ml의 멸균 양서류 인산염 완충 식염수 또는 실온에서 전쟁 전 PBS를 복막강에 주입합니다. 바늘을 제거하고 주입된 완충액이 체강 내의 액체와 동일한지 확인하기 위해 1분 동안 개구리를 부드럽게 마사지합니다.

다음으로 주사기가 없는 새로운 18게이지 1.5 바늘을 개구리의 복부에 삽입합니다. 혈관을 피하면서 바늘 뒤쪽에서 떨어지는 복막액을 깨끗한 50ml 원뿔형 튜브에 모으십시오. pls를 수확한 후 가능한 한 많은 초기 주입 부피를 회수해야 합니다.

개구리가 깨어날 때까지 얕은 물이 담긴 용기에 개구리를 넣으면 우리에 다시 넣을 수 있습니다. pls가 수확되면 섭씨 4도에서 10분 동안 1000RPM으로 원심분리하고 sup, natant 및 resus를 제거합니다. 차가운 A PBS에 pls를 중단하십시오.

RESUSPENDED pls를 1.5ml 마이크로 쓰레기 튜브로 옮깁니다. GP 96으로 PLS를 펄스합니다. pls에 적당량의 GP 96을 첨가하고 1 시간 후 1 시간 동안 얼음에서 피펫팅으로 배양하여 혼합합니다.

14, 1 분 동안 000 분당 회전수로 세포를 분리기를 제거하십시오. 결합되지 않은 GP 96을 제거하려면 상층액을 제거하십시오. 차가운 A PBS와 소생술을 추가합니다.

PLS 원심분리기를 다시 일시 중단합니다. 마지막 세척 후 G 96이 남아 있지 않도록 차가운 A-P-B-S-A로 S를 총 세 번 세척합니다. Resus는 펄스된 pls를 PBS의 300마이크로리터당 5 pls에 10의 5배의 농도로 현탁시켜 pls를 순진한 LG 6명의 수신자에게 채택적으로 전달합니다.

복강내: 동물당 300마이크로리터의 펄스 플스를 주입합니다. 개구리는 다음에 보여줄 피부 이식 또는 종양 챌린지 실험 최소 3일 전에 프라이밍을 해야 합니다. 이식을 위한 피부는 마취된 LG 15 기증자 개구리에서 얻습니다.

가위를 사용하여 은빛으로 보이는 복부 피부인 복부 피부의 작은 조각을 잘라 제거합니다. 이식편을 취급하는 동안 4 개의 색소 세포가 존재하는 ARI로 인해. 이식편에 손상을 줄 수 있으므로 가능한 한 조직을 조작하지 않는 것이 중요합니다.

집게로 피부를 아주 부드럽게 잡고 차가운 A PBS가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 페트리 접시를 켜두십시오. 새 유리 슬라이드에 피부를 놓고 면도기를 사용하여 개별 이식편을 5mm x 5mm 조각으로 자릅니다.

조각을 얼음 위의 PBS에 보관하여 LG Six 수혜자 개구리에 피부를 이식합니다. 먼저, 마취된 수혜자의 등쪽 피부를 작게 절개합니다. 그런 다음 은빛 면이 위로 향하게 하여 피부 아래에 5mm x 5mm 이식편을 삽입합니다.

이식편에 있는 가위와 겸자 표시는 이식 거부 반응으로 간주되지 않으므로 반드시 기록해 두십시오. 24시간 후 채점이 시작되면 이식편에서 오버레이 숙주의 피부 일부를 제거해야 합니다. 가위를 사용하여 이식편 주위의 창을 잘라내어 이식편을 자유롭게 시각화할 수 있습니다.

기증자의 피부를 만지거나 출혈을 유발하지 않도록 주의한다. 스케치를 하여 바로 이식편에 점수를 매기기 시작하십시오. 피부 이식.

거부 반응은 이식된 피부의 아리돌 파괴 비율에 따라 결정됩니다. 이식편은 실체 현미경으로 2-3일에 한 번씩 점검해야 합니다. 소련에 의한 이식을 위해 종양 세포를 준비하고, 300 마이크로 리터 당 5 개의 세포에 대해 5 곱하기 10의 밀도로 종양 배양 배지에 현탁시킵니다.

동물의 등쪽 한쪽에 피하 주사로 세포를 이식합니다. 개구리 당 300 마이크로 리터 부피의 5 개의 세포에 10 곱하기 10을 주입합니다. 종양 성장은 종양 챌린지 후 2-3주 이내에 시작됩니다.

초기 종양 모양을 주목하십시오. 캘리퍼스를 사용하여 종양의 치수를 측정하고 개구리에서 혈액 백혈구를 채취하기 2-3일마다 종양의 양을 기록합니다. 불 위로 파스타 펩스를 당겨 유리 바늘을 준비합니다.

실체 현미경으로 피펫의 미세한 끝을 날카롭게 한 후 피펫을 흡인 플라스틱 튜브에 연결합니다. 혈액 채취를 시작하려면 마취된 개구리의 뒤쪽 발 위의 피부를 잘라 등쪽 족절 정맥을 노출시킵니다. 유리 바늘에 1-2ml의 얼음처럼 차가운 A PBS와 헤파린 용액을 채웁니다.

그런 다음 유리 바늘을 정맥에 삽입하고 입으로 천천히 흡인하여 혈액을 모으기 시작합니다. 평균 크기의 개구리 한 마리에서 1-2밀리리터의 혈액을 얻을 수 있습니다. 개구리 다리의 작은 절개 부위는 꿰맬 필요가 없습니다.

상처는 일주일 이내에 치유됩니다. 이식 후 12일 후 피부 이식 거부 반응에 대한 입체 현미경 분석 결과가 여기에 나와 있습니다. MHC 동일한 LG 6 기증자로부터 피부 이식을 받은 LG 6 복제 개구리는 거부 반응을 보이지 않았습니다.

별표는 거부로 인한 것이 아닌 마커 겸자를 나타냅니다. 대조적으로, MHC 이종 근친 기증자로부터 피부 이식을 받은 LG 6 복제 개구리는 80%의 거부 반응을 보입니다. 두 이미지 모두에서 화살표는 은빛 홍채를 띤 4개의 색소 세포가 거부되지 않은 이식된 조직을 나타냅니다.

다음 실험에서는 대장균 배양에서 정제된 음성 대조군 재조합 GP 96 또는 15개의 제로 종양 조직 세포에서 정제된 GP 96으로 PBS로 LG 15 pls를 펄스한 다음 LG 15명의 성인 수혜자에게 채택하여 이식하고 3일 후에 살아있는 15개의 제로 종양 세포를 챌린지 후 며칠 만에 처음 나타난 피하 주사 종양으로 이식하고 종양 크기를 주기적으로 측정했습니다. 이 그래프, 각 곡선은 한 개구리에서 종양 성장의 동역학을 나타냅니다. 그 결과, 0.5 또는 1마이크로그램의 GP 96을 투여한 동물은 대조군에 비해 종양 출현이 현저히 지연되었음을 보여줍니다. 그러므로, GP 96은 이종이물에서 종양 항원의 교차 발현을 용이하게 합니다.

그래서 우리는 피부 이식 및 종양 이식 분석을 통해 frog xap lavis에서 경미 항원과 종양 항원을 모두 나타내는 GP 96의 능력을 탐구하는 방법을 보여주었습니다. 이 절차를 수행할 때 대식세포가 아닌 적혈구 내의 대부분의 세포가 혈관이 손상된 경우 복막 세척을 수집하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 손상을 방지하기 위해 피부 이식을 조작할 때 겸자로 조직을 짜지 않는 것도 중요합니다.

그게 다야. 씻어 주셔서 감사하고 실험에 행운을 빕니다.