Name: 비교적 생체내에 학습 Xenopus laevis /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-16T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 학습하세요 Xenopus laevis에서 gp96이 항원 특이적 CD8 T 세포 반응을 촉진하는 역할을 면역학 연구에 활용하는 방법을. 이 기법은 피부 이식 거부 및 종양 면역 반응을 평가하는 데 유용합니다.

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티나 마틴과 데이비드 올브 라이트에서 제공하는 전문가 동물 축산은 기꺼이 감사합니다. 이 연구는 NIH에서 교부금 T32 - AI - 07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03 - HD061671 - 01, R24 - AI - 059830-06에 의해 지원되었다.

1. 동물 X. laevis X X. gilli 하이브리드 LG - 6와 LG - 15 isogenetic 클론 1 로체스터 (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm)의 대학의 번식 식민지에서입니다. LG - 6와 LG - 15 공유 같은 heterozygous MHC haplotype (A / C)하지만 사소한 histocompatibility (H) loci에서 다릅니다. 이 클론의 자손은 여성에 의해 만들어진 diploid 달걀은 UV - 조사 정자 (자손없이 DNA 기여)에 의해 활성화하는, gynogenesis에 의해 생산됩니다. 장갑의 사용은 통성 있습니다. 어떤 사람은 개구리를 처리하기 어렵습니다 (미끄러)와 사실 그것은 개구리 불편하게 만드는 나타나기 때문에 그들을 착용하지 선호합니다. 2. 15 / 0 종양 (종양 및 H - AGS 마이너를 모두 표현)의 gp96의 정화 Gp96 정화는 이전에 다음 ID로 2, 3을 설명하고 있습니다. 간단히, gp96는 코나 - 세파 로스와 DEAE 크로마 토그래피 다음 50~70%의 암모늄 황산 분별 (분리)로 정화됩니다. 단백질의 약 20-50 μg는 종양 조직의 1 ML 당 얻을 수 있습니다. 준비 순도는 SDS - PAGE와 은색 염색법에 의해 결정됩니다. 3. 마이너 H - AG - 이질 LG - 6 프로그에서 복막 Leukocytes (PLS)의 이끌어 냄과 추수 <ol><li> 25 ML 하루 E. 그로 37 50 ML 원뿔 관에서 대장균 문화 ° 잡고 C. </li><li> 다음날 열은 1 시간 동안 그것을 끓는하여 박테리아를 죽일. </li><li> E.을 죽인 열을 원심 분리기 4 2,000 RPM (1,500 G) ° C. 15 분 대장균 </li><li> 뜨는을 제거 1 / 10 일 APBS에서 원래 문화 볼륨 (2.5 ML)의 박테리아 펠렛을 resuspend. 이 시점에서 세균성 문화 사용할 수 있습니다 24 시간 이내에 사용하셔야합니다. </li><li> intraperitoneally (IP) 200 (2 인치 개구리의 경우) 또는 25 게이지 8분의 5 바늘을 사용하여 개구리 당 열 죽이고 박테리아 준비 300 μL를 (3 인치 개구리)을 주입. </li><li> 사출 PLS 후 3 일이 intraperitoneal 세척하여 수확하고 있습니다. </li><li> 모든 운동 (기간은 크기와 연령에 따라) 중단까지 PL의 수확하기 전에, 성인 개구리는 최대 5 분하는 나트륨 중탄산염와 버퍼 tricaine의 메탄 설 폰 산염 (TMS, MS - 222)의 0.1 % 수용액에 침지하여 anesthetized 있습니다. 동물 치료 후 10-20 분 이내에 일어나. </li><li> 70 % 에탄올을 소량으로 개구리의 복부를 소독. </li><li> 5 ML (2 인치 개구리의 경우) 또는 멸균 APBS 18 게이지 1 ½ 바늘을 사용하여 복막 캐비티에 실온에서 사전 예열 10 ML을 (3 인치 개구리)을 주입. 바늘을 제거하고 부드럽게 주입 버퍼가 뱃속에있는 액체와 equilibrates 것을 막기 위해 잠시 동안 개구리를 마사지. </li><li> 깨끗한 50 ML 원뿔 관에 바늘 뒤쪽에서 똑됩니다 복막 유체를 수집하는 주사기없이 새 18 게이지 1 ½ 바늘을 사용합니다. 가능한 한 초기 주입 볼륨의 많은를 검색할 수 있는지 확인하십시오. 복부 지역의 중심 지역에 혈관을 피하기 위해주의하십시오. </li><li> 그것은 그 새장에 다시 삽입할 수있는 지점에 깨어 때까지 일단 PLS는 얕은 물로 용기에 개구리를 넣어 수확하고 있습니다. </li></ol> 4. 나이브 LG - 6 수신자으로 LG - 6 PLS의 Pulsing 및 입양 전송 <ol><li> 감기 APBS로 번 PLS를 씻어 4 10 분 ° C. 1,000 RPM (750g)에 그들을 원심 분리기 </li><li> 뜨는를 제거하고 APBS의 PLS를 resuspend. </li><li> 5 X 10 5 PLS 당 1 μg gp96의 농도에 gp96와 PLS를 펄스. </li><li> gp96의 적절한 금액은 PLS에 추가되면, 1 시간 동안 얼음에 pipeting와 부화하여 그들을 섞는다. </li><li> 어떤 언바운드 gp96를 제거하는 4 10 분 1,000 RPM ° C에서 또는 1 분 14,000 RPM에서 두 세포를 원심 분리기. </li><li> 여운 gp96 남아가 없습니다 않도록 추위 APBS와 배 PLS 씻으십시오. </li><li> 300 μL 당 5 X 10 5 PLS의 농도에서 펄스 PLS를 Resuspend. </li><li> Adoptively 25 게이지 8분의 5 바늘을 사용하여 IP 주입하여 PLS를 전송. 동물마다 펄스 PLS (5 X 10 5 세포) 300 μL를 주입. </li><li> 개구리 피부 이식이나 종양 과제 실험을 계속하기 전에 최소 3 일 끝났다해야합니다. </li></ol> 5. 피부 이식 분석 피부 이식의 거부는 Xenopus 4, 5, 6에서 잘 확립 분석이다. Xenopus에서,받는 사람은 21-22에서 18~22일 이내에 1 또는 2 MHC haplotype의 불일치를 표시 기증자 피부 ° C. 거부 반면, LG - 6와 가벼운 H - AGS에 의해서만 차이가 LG - 15 클론 사이의 피부 이식은 (30 일 해당) 더 느리게 거부됩니다. 그러나이 거부는 수신자 THA에 가속입니다t은 이전의 피부 이식 또는 기증자로부터 정화 gp96과 예방 접종을 통해 기증자 사소한 H - AGS에 대해 제일 먼저 처리 해달라고했습니다. 전혀 거부는 기증자와받는 사람이 유전자 (복제, 예 또는 전적으로 타고난 동물) 동일 경우 발생하지 않습니다. 따라서,이 간단한 기술은 gp96로 elicited 생체내 면역 반응의 특성화를위한 매우 강력합니다. <ol><li> 로 3.7에 설명되어있는 기증자의 개구리를 마취. 참고 : Xenopus 총 무균 절차에 대한 필요성을 obviates 피부에 강력한 안티 - 미생물 펩티드 (예 : magainin) 생산 이후에만 최소한의 예방 조치가 이동해야합니다. 사실, 모든 살균제와 개구리의 치료는 피부에 해로운 것입니다. 또한, Xenopus은 인간에게 전송할 수있는 병원균이 없습니다. 따라서, 장갑의 사용은 선택 사항입니다. 그러나, 사용되는 모든 해부 악기는 autoclaved해야 할 모든 솔루션을 살균해야합니다. </li><li> 가위를 사용하여 LG - 15 기증자 개구리의 복부 피부의 조각 (때문에 irridophore 색소 세포의 존재에 은빛 나타나는 복부 피부) (X 5mm를 20mm) 잘라 작은 제거합니다. </li><li> Petridish 포함 APBS의 피부를 삽입하고 얼음에 보관하십시오. 아주 부드럽게 피부 조직을 조작, 포셉 사이에 그것을 들고 마십시오. </li><li> 면도칼이나 가위를 사용하면 5mm로 X 5mm의 조각 개별 이식 잘라. 얼음 APBS의 조각 보관하십시오. </li><li> 그것은 항생제를 (5 MG / L의 농도에서 Penstrep)가 포함된 물에 배치됩니다 깨어 후 때까지이 시점에서 기증 개구리는 얕은 물로 용기에 배치됩니다. 개구리는 그것이 일반 물에 반환되는 시점에 이틀 동안 항생제와 함께 물 속에 보관됩니다. 피부가 제거된 사이트에 작은 상처가 달고 다니는해야하며 일주일 이내 치유되지 않습니다. </li><li> 받는 LG - 6 개구리를 마취. </li><li> 받는 사람의 지느러미 (다시) 피부에 작은 절개를 만들고 은색 면을 피부 아래의 5mm X 5mm 그래프트를 삽입합니다. 그 변위 또는 이식의 손실로 이어질 수 있기 때문에 피부 아래의 대형 공기 방울을 소개하지 않도록주의하십시오. </li><li> 채점이 시작되면 이들은 이식 거부 반응으로 계산하지 않기 때문에 당신이 이식에 가위와 집게 표시를 참고 있는지 확인하십시오. </li><li> 24 시간 후에 오버레이 호스트 피부의 일부가 이식에서 제거되어야합니다. </li><li> 받는 LG - 6 개구리를 마취. 5.1에서 설명한대로 동물을 취급하고 있습니다. </li><li> 이식 자유롭게 시각 수 있도록 autoclaved 가위를 사용하면 이식 주위에 창 밖을 잘라 버릴거야. 기증자 피부를 만지거나 출혈을 유발하지 않도록주의하십시오. 5.5에서 설명하는 것처럼 개구리는 회복하자. </li><li> 스케치를 취하여 바로 그래프트를 채점 시작합니다. 피부 이식의 거부는 이식할 피부 irridophores 파괴의 비율에 의해 결정됩니다. </li><li> 이식 2-3 일마다 검사해야하지만 동물이 일을 anesthetized 될 필요가 없습니다. 이식을 시각화하기 위해 개구리 해부 현미경 petridish에 배치해야합니다. </li></ol> 6. 이식 피부의 전체 마운트 Immunohistology 프로그 전체 - 마운트 immunohistology는 이전에 다음 ID로 6 설명했습니다. 간단히, 개구리 anesthetized와 개구리 물 (작업 공간도 무균 준비)로 사전에 젖은 멸균 종이 타월에 현미경으로 배치됩니다. 이식 피부가 다음 호스트 피부 주변의 작은 금액을 함께 수확하고 있으며 그것은 유동세포계측법 분석 6 셀 얼룩 비슷하게 항체 물들일 것입니다. Autoclaved 악기 및 살균 버퍼는 사용해야합니다. 피부 얼룩 후 현미경 슬라이드에 배치하고 부드럽게 커버 전표와 함께 누르면. 이 시점에서 피부 이식을 침투가 다른 세포 집단을위한 형광 현미경을 사용하여 시각하실 수 있습니다. 섹션 5.5에서 설명한대로 절차 후 개구리는 항생제로 물에 유지됩니다. 와 일반 물에 돌아왔습니다. 피부가 제거 어디에 왼쪽으로 작은 상처가 일주일 이내 깨끗하 데요. 7. 혈액 Leukocytes의 특성화 <ol><li> 개구리의 혈액을 제거하기 전에, 하나 이상의 멸균 화염 파스퇴르 pipettes를 당기는하여 "유리 바늘"을 준비해야합니다. 피펫의 벌금 끝단은 stereomicroscope 아래 날카롭게입니다. 피펫은 다음 열망 플라스틱 튜브에 연결되어 있습니다. 같은 포셉 및 가위 등 모든 악기 사용하기 전에 autoclaved해야합니다. </li><li> 또한 APBS 1 ML 당 헤파린 50 단위를 추가하여 APBS과 헤파린 솔루션의 얼음 차가운 10 ML을 준비합니다. 얼음 솔루션 보관하십시오. 사용된 모든 솔루션 살균해야합니다. </li><li> 3.7에서 설명한대로 개구리를 마취하고, 같은 5.1에서 설명한 동일한 동물 처리 절차를 따르십시오. . </li><li> 노출에 대한 사후 발 위에 피부를 잘라지느러미 족근의 정맥. </li><li> APBS + 헤파린 용액 1-2 ML과 파스퇴르 피펫을 입력합니다. </li><li> 정맥에 "유리 바늘"을 넣고 천천히 입으로 aspirating하여 혈액을 수집 시작합니다. 이것은 혈액 응고와 바늘의 팁을 막히는에서 혈액을 방지하기 때문에 그것은 "유리 바늘"에 APBS + 헤파린 솔루션을 가지고하는 것이 중요합니다. </li><li> 혈액 1 ~ 2 ML 하나의 평균 크기의 개구리에서 얻을 수 있습니다. </li><li> 개구리 다리에있는 작은 절개는 꿰매 필요하지 않으며 상처가 일주일 이내에 치유. </li><li> 4 10 분 1,000 RPM에서 혈액을 원심 ° C. </li><li> 뜨는를 제거하고 차가운 APBS 10 ML과 1X 세포를 씻으십시오. </li><li> ficoll Histopaque 1.077 (시그마)는 적혈구에서 혈액 leukocytes을 구분하기 위해 상온에서 사전 예열 1 ML에 혈액의 중첩이 ML (1-5 X 10 6 세포). </li><li> 없이 브레이크와 함께 상온에서 1,000 rpm으로 20 분 원심 분리기 다음 백혈구 밴드를 수집합니다. </li><li> 4 10 분 1,400 rpm으로 원심 분리에 의해 APBS와 2X 세포를 세척 ° C 잔류 ficoll을 제거합니다. </li><li> 이 시점에서 세포 유동세포계측법 분석을위한 항체 물들일 준비, 또는 체외 문화 assays에 사용 될 수 있습니다. </li></ol> 8. 종양 이식 분석 <ol><li> 약 일주일 새 15 / 0 종양 세포의 배치와 세포가 잘 성장 시작되었는지 확인 밖으로 실험 해동하기 전에. 문화 매체가 간결 다음 섹션에서 3에서 자세히 설명되어 있습니다. </li><li> 15 / 0 종양 세포를 확장합니다. </li><li> 실험 당일에 세포를 세고 Trypan 파랑 제외 의한 세포 죽음을 결정합니다. 세포 죽음은 5 % 미만되어야합니다. 4 천 rpm으로 추위 APBS에 1X 세포 및 원심 분리기를 씻어 ° C, 10 분. </li><li> 300 μL 당 5 X 10 5 15 / 0 세포의 밀도에 종양 배지에서 세포를 Resuspend. </li><li> 동물의 등의 (뒤쪽) 측면 한쪽에 25 게이지 8분의 5 바늘을 사용하여 피하 주사에 의해 개구리 300 μL 볼륨에 이식 5 X 10 5 세포. </li><li> 종양 성장은 종양 도전 후 2-3 주 내에 시작됩니다. 초기 종양의 외관은 주목하고 종양 볼륨 2-3 일마다 기록해야합니다. 종양 부피 (높이 X 길이 X 너비)는 캘리퍼스를 사용하여 측정됩니다. </li><li> 종양이 3,500mm 3 커지거나 개구리는 기면 찾고 시작되면, 그것은 불편을 방지하기 위해 euthanized해야합니다. </li></ol> 9. 시약이 필요 : <ul><li> 6.6 g / L NaCl, 1.15 g / L 나 2 HPO 4, 0.2 g / L KH 2 PO : 수륙 양용 인산이 살린 (APBS)를 버퍼. 10N NaOH와 필터를 사용 산도 7.5 필터 0.2 μm의를 통해 살균. </li><li> Tricaine의 메탄 설 폰 산염 (TMS, MS - 222) (크레 스 켄트 연구 화학 CAS # 886-86-2). </li><li> 나트륨 중탄산염 (피셔 사이 언티픽 S - 233-500). </li><li> Histopaque - 1077 (시그마 - 알드리치 10771-100 ML) </li><li> 헤파린 나트륨 소금 (시그마 - 알드리치 H3149 - 50KU) </li><li> Xenopus 15 / 0 종양에 대한 문화 매체 [자세한 내용은 3 참조] : 10 ML의 인슐린, 10 ML 아닌 필수 아미노산, 10 ML 페니실린 - 스트렙토 마이신과 Iscove DMEM 기초 중간 1 L (Gibco - Invitrogen 11,965) 10 μg / Kanamycin의 ML; primatone (셰필드 제품 사업부), β2 - 메르 캅 토 에탄올 1 ML, 그리고 물에 3.02 g NaHCO 3 (산도 7.0) 3 ML. 이 매체는 30% 더블 증류수를 추가하여 수륙 양용 osmolarity로 희석하고, 5% 태아 소 혈청, Xenopus의 신장 세포 라인 A6에서 20 % superantant, 그리고 정상 Xenopus 혈청의 0.25 %로 보충합니다. </li></ul> 10. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 피부 이식 거부 12일 포스트 이식의 Stereomicroscopic 분석. LG - 6 복제 개구리 중 (A) MHC - 동일 LG - 6에서 피부 이식을받은 것은 (아무 거부를 표시하지 않음) 또는 (b) MHC - 이질 outbred 기증자 (80 % 제거). 화살표 건강 (비 거부) 이식할 조직을 표시 은빛 iridophore 색소 세포를 보여줍니다. (*)의 마크는 거절로 인해하지 포셉. <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. Gp96는 Xenopus의 종양 항원의 교차 프레 젠 테이션을 용이하게합니다. LG - 15 PLS (5 × 10 5) APBS (대조군), E.의 정화 재조합 gp96 1 μg과 중 얼음에 1 시간을위한 펄스되었습니다 gp96의 콜리 문화, 또는 1 또는 0.5 μg 15 / 0 종양 조직에서 정화. 3 세척 후, 세포가 adoptively LG - 15 성인 수신자로 전송되었습니다 (1 × 10 6 / 개인). 사흘 후, 15 / 0 종양 세포 (5 × 10 5)되었습니다 라이브SC 주입하여 이식. 각 곡선 한 개구리의 종양 성장 속도론을 나타냅니다. 종양이 처음 출현 일 게시 도전 모니터링했고, 종양 크기는 캘리퍼스 (길이 X 폭 X 두께)를 주기적으로 결정했다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

수륙 양용 Xenopus은 면역력을 공부하는 독특한 다목적 아닌 포유 동물 모델입니다. 생명 의학 및 면역 연구에 광범위한 사용에는 MHC 정의 클론 LG - 6와 LG - 15뿐만 아니라 다른 세포 라인과 단클론 항체와 같은 많은 중요한 연구 도구가 생긴 거죠. 우리가 강력한 AG - 특정 안티 - 사소한 H - AG 및 안티 종양 T 세포 응답 7 중재하기 위해 gp96로 열 충격 단백질의 기능 연구를 체외에서 생체내 assays에서 다른 설립 이러한 도구를 사용합니다. 이 모델은 시스템은 우리가 더욱 프라이밍 및 효과기 세포 단계에서 gp96 면역 속성을 조사 수 있습니다. 마중물 단계 등 접목 피부 종양 이식 2 8로 생체내 assays에서 전에 두 주일 간격으로 10 μg gp96의 두 주사 필요한 것을 gp96를 정화와 피하 예방 접종 사용이 반응의 초기 연구에 관한. 비교에서,...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;필요 시약:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>양서류 인산 완충 식염수 (APBS): </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 1.15 g/L </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.2 g/L </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10N NaOH </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) </td><td>Crescent Research Chemicals</td><td>CAS#886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>탄산수소나트륨 </td><td>Fisher Scientific</td><td>S-233-500</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>100ml</td></tr><tr><td>헤파린 나트륨염 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus 15/0 종양용 배양 배지 [자세한 내용은 3번 참조]:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove DMEM 기본 배지</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>카나마이신</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primatone</td><td>Sheffield Products Division</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;2-mercapt&amp;#8211;thanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% 이중 증류수 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% 소태아 bovine serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20% Xenopus 신장 세포주 A6 상층액 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25% 정상 Xenopus 혈청</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;재료 및 장비:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 및 15 ml 원추형 원심 분리 튜브 (멸균)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 gauge 5/8 Precision Glide 멸균 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 gauge 1&amp;frac12; Precision Glide 멸균 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Tuberculin Slip Tip 멸균 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml Slip Tip 멸균 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml MicroCentrifuge 튜브 (멸균)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 X 15 mm 폴리스티렌 페트리 접시 멸균</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 X 75 mm X 1 mm 프리미엄 현미경 슬라이드 </td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm 유리 페트리 접시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9&quot; 파스퇴르 피펫 Durex 붕규산 유리 면 마개 일회용</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td># 5 Swiss Jeweler&amp;rsquo;s 핀셋 2개</td><td>Miltex Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas 미세 해부용 스프링 가위 직선 절단날 6 mm</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helios 캘리퍼스 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>고강도 조명기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈구 계수기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Un-bunsen 버너</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C 진탕 배양기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

비교적 생체내에</em개구리의 gp96 adjuvanticity의> 학습 xenopus laevis</em

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

우리는 수륙 양용 Xenopus의 개발은 chaperoned 항원의 교차 프레 젠 테이션을 촉진하고 타고난 및 적응 T 세포 반응을 이끌어내는 수 있습니다. Xenopus 피부 이식 거부와 같은 gp96와 같은 특정 열 충격 단백질 (hsps)의 능력을 연구하기위한 독특한 아닌 포유 동물 모델을 laevis 고전 MHC 클래스 구이 (클래스 구이) 제한 T 세포 반응을 이끌어내는 위해 gp96의 능력을 연구하는 뛰어난 플랫폼을 제공합니다. 또한, Xenopus 모델 시스템은 또한함으로써 면역 감시를 탈출 자신의 클래스 구이 분자를 아래로 조절이 종양에 대한 응답을 생성하는 gp96의 능력을 탐험 마우스에 대한 매력적인 대안을 제공합니다. 최근, 우리는 항원 제시 세포 (APCs)로 복막 leukocytes를 사용하여 Xenopus 클론에서 입양 세포 전송 분석을 개발하고, 같이 가지고 가벼운 histocompatibility 피부 항원에 대한뿐만 아니라 Xenopus thymic 종양 15에 대한 생체내에 gp96 수있는 최고급 CD8 T 세포 응답 클래스 구이 분자를 표현하지 않습니다 / 0. 우리는 여기서 복막 leukocytes의 이끌어 냄, pulsing과 입양 전송뿐만 아니라 피부 이식 및 종양 이식 assays 포함하여 이러한 assays을 수행하기 위해 관련된 방법론을 설명합니다. 또한 우리는 유동세포계측법 피부 제거 및 안티 종양 반응에 관여 효과기 인구의 자세한 특성화를 허용 확산 assays에 사용되는 주변 혈액 leukocytes의 수확과 분리를 설명하고 있습니다.

개구리<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 항원에 특정한 CD8 T 세포 응답을 촉진하기 위해 gp96로 열 충격 단백질의 기능을 탐험에 대한 매력적인 대안이 아닌 포유 동물 모델을 제공합니다. 우리는 방법을 연구 제시<em&gt; 생체내에</emgp96로 피부 종양 항원의 교차 프레 젠 테이션&gt; 촉진.

비교적 생체내에</em개구리의 gp96 Adjuvanticity의> 학습 Xenopus laevis</em

우리는 특정 열충격 단백질(hsp), 예를 들어 gp96이 ... 하는 능력을 연구하기 위해 양서류인 *Xenopus laevis*를 이용한 독특한 비포유류 모델을 개발하였습니다.

이 절차의 전반적인 목적은 개구리 Xenopus laevis에서 열충격 단백질 GP96이 항원 특이적 CD8 T 세포 반응을 촉진하는 진화적 보존 능력을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 복강 세척을 통해 복강 백혈구를 수집함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 배양 및 세척 후, 마이너 항원과 종양 항원을 샤페론하는 종양 유래 GP96으로 복강 백혈구를 펄싱하는 것입니다.종양 또는 부형질항원(minor histocompatibility antigens)에 대해 개구체를 감작시키기 위해, 복강 백혈구를 나이브 개구체에 복강 내 주입하여 입양 전이시킵니다. 절차의 세 번째 단계는 감작된 개구체에 피부 이식을 수행하거나 종양을 접종한 후, 피부 이식 거부 반응의 시작 또는 종양의 발생 여부를 모니터링하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 말초혈을 채취하여 피부 거부 및 항종양 반응에 관여하는 T 세포의 특성을 분석하는 것입니다.최종적으로, 피부 이식 및 종양 챌린지 분석을 통해 각각 GP 96 프라이밍을 거친 개구리에서 피부 이식 거부 반응의 유의미한 가속화와 종양 발생의 지연을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 의료 센터 미생물학 및 면역학과의 Dr. Jacque Robert 연구실의 Christina Koska입니다. 저는 마찬가지로 Dr. River 연구실 소속인 Tanya Cruz입니다.오늘은 복강 백혈구의 입양 전이를 통해 클론 개구리를 프라이밍하고, 이어서 피부 이식 및 종양 이식 분석을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다. 또한, 이 동물들로부터 말초 혈액을 얻는 방법도 함께 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 통해 열충격 단백질 GP 96이 Xenopus laevis에서 항원 특이적 CD4+ T 세포를 촉진하는 능력과 여기에 관여하는 세포 유형을 연구하고 있습니다.그럼 시작해 보겠습니다. 본 실험에 사용된 개구리는 로체스터 대학교(University of Rochester)의 번식 콜로니에서 얻은 ISO 유전적 클론입니다. 수확을 위해 복막 백혈구(peritoneal leukocytes, PLs)를 유도하려면, 마취된 개구리의 복강 내에 25게이지 5/8인치 바늘을 사용하여 열처리로 사멸시킨 E. coli 조제물을 주입하십시오. 주입 3일 후, 복강 세척법을 통해 PLs를 수확합니다.이 절차를 시작하려면, 마취된 개구리의 복부를 소량의 70% ethanol로 소독합니다. 그다음 18 gauge 1.5 바늘을 사용하여 멸균된 양서류 인산 완충 식염수 또는 상온에서 예열된 PBS 5 mL를 복강 내에 주입합니다. 바늘을 제거하고 개구리를 1분 동안 부드럽게 마사지하여 주입된 완충액이 체강 내의 액체와 잘 섞이도록 합니다.다음으로, 주사기가 없는 새로운 18 gauge 1.5 바늘을 개구리의 복부에 삽입합니다. 혈관을 피하면서 바늘 뒤쪽으로 떨어지는 복막액을 깨끗한 50 milliliter 원추형 튜브에 수집합니다. pls를 수확한 후에는 처음에 주입한 부피를 최대한 많이 회수하십시오.개구리가 깰 때까지 얕은 물이 담긴 용기에 넣어 둔 후, 다시 케이지로 옮깁니다. pls를 수확한 후, 4°C에서 1000 RPM으로 10분간 원심분리하고, sup과 natant를 제거한 뒤 resus합니다. pls를 차가운 A PBS에 현탁합니다.부유시킨 pls를 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. GP 96으로 PLS를 펄싱하기 위해, 적정량의 GP 96을 pls에 첨가하고 피펫팅하여 섞어줍니다. 얼음 위에서 1시간 동안 배양한 후, 1시간이 지나면 다음 단계로 진행합니다.세포를 14,000 RPM에서 1분 동안 원심분리합니다. 결합되지 않은 GP 96을 제거하기 위해 상층액을 제거합니다. 차가운 A PBS를 첨가하고 재현탁합니다.PLS 원심분리기를 다시 가동합니다. S를 차가운 A-P-B-S-A로 총 세 번 세척하여 마지막 세척 후 G 96 잔류물이 남지 않도록 합니다. 펄스 처리된 pls를 PBS 300 µL당 5 × 10⁵ pls 농도로 재현탁하여 naive LG 6 수용체로 pls를 입양 전이합니다.동물당 300 µL의 pulsed pls를 복강 내 주사합니다. 개구리는 다음에 설명할 피부 이식 또는 종양 유도 실험을 수행하기 최소 3일 전에 프라이밍 처리를 해야 합니다. 이식용 피부는 마취된 LG 15 공여 개구리로부터 얻습니다.가위를 사용하여 은색으로 보이는 복부 피부인 복측 피부의 작은 조각을 절제하여 제거하십시오. 이식편을 취급할 때 ARI로 인해 4개의 색소 세포가 존재합니다. 조직 조작을 최소화하는 것이 매우 중요한데, 이는 과도한 조작이 이식편 손상을 유발하기 때문입니다.포셉으로 피부를 매우 부드럽게 잡고 차가운 A PBS가 들어있는 페트리 접시에 넣습니다. 페트리 접시를 그대로 둡니다. 피부를 깨끗한 유리 슬라이드 위에 올리고 면도날을 사용하여 개별 이식편을 5 mm x 5 mm 크기로 자릅니다.피부 조각을 LG six 수용 개구리에 이식하기 위해 얼음 위의 PBS에 보관하십시오. 먼저, 마취된 수용 개구리의 등 쪽 피부에 작은 절개를 만듭니다. 그런 다음 5 mm × 5 mm 크기의 이식편을 은색 면이 위로 향하게 하여 피부 아래로 삽입하십시오.가위와 포셉으로 표시한 부분은 이식 거부 반응으로 간주되지 않으므로 반드시 이를 기록해 두어야 합니다. 24시간 후 점수 측정이 시작되면, 이식물 위에 덮인 숙주의 피부 일부를 제거해야 합니다. 가위를 사용하여 이식물 주변으로 창을 내듯 절개하여 이식물을 자유롭게 관찰할 수 있도록 합니다.공여 부위의 피부를 건드리거나 출혈을 유발하지 않도록 주의하십시오. 스케치를 통해 이식 부위의 표시를 즉시 시작하십시오. 피부 이식.거부 반응은 이식된 피부에서 aridol의 파괴 백분율로 결정합니다. 2~3일마다 실체 현미경으로 이식편을 확인해야 합니다. 종양 배양 배지에서 300 µL당 5 × 10⁵ cells의 밀도로 세포를 부유시켜 이식용 종양 세포를 준비합니다.동물의 등쪽 한 곳에 피하 주사를 통해 세포를 이식합니다. 개구리 한 마리당 300 µL 부피에 5 × 10⁵ 개의 세포를 주입합니다. 종양 유도 후 2~3주 이내에 종양 성장이 시작됩니다.초기 종양의 외관을 관찰하십시오. 캘리퍼스를 사용하여 종양의 크기를 측정하고, 개구리로부터 혈액 백혈구를 채취하기 전까지 2~3일마다 종양의 부피를 기록하십시오. 파스타 펩스를 불꽃 위에서 가열하여 당김으로써 유리 니들을 준비하십시오.입체 현미경 하에서 피펫의 미세 끝부분을 날카롭게 다듬은 후, 피펫을 흡입용 플라스틱 튜브에 연결합니다. 혈액 채취를 시작하려면 마취된 개구리의 뒷발 위쪽 피부를 절개하여 등쪽 족근정맥을 노출시킵니다. 유리 바늘에 1~2 mL의 얼음처럼 차가운 A PBS 및 헤파린 용액을 채웁니다.그런 다음 유리 바늘을 정맥에 삽입하고 입으로 천천히 흡인하여 혈액 수집을 시작합니다. 평균 크기의 개구리 한 마리당 1~2 mL의 혈액을 얻을 수 있습니다. 개구리 다리에 낸 작은 절개 부위는 봉합할 필요가 없습니다.상처는 일주일 이내에 치유될 것입니다. 이식 후 12일째의 피부 이식 거부 반응에 대한 실체 현미경 분석 결과가 여기에 제시되어 있습니다. MHC가 동일한 LG six 공여체로부터 피부 이식을 받은 LG six 클론 개구리는 거부 반응을 보이지 않았습니다.별표는 거부 반응으로 인한 것이 아닌 마커 포셉을 나타냅니다. 이와 대조적으로, MHC가 다른 외교배 공여자로부터 피부 이식을 받은 LG 6 클론 개구리는 80%의 거부 반응을 보입니다. 두 이미지 모두에서 화살표는 거부 반응이 없는 건강한 이식 조직을 나타내는 은색의 홍채포 색소 세포를 가리킵니다.다음 실험에서는 LG 15 수지상세포에 음성 대조군인 PBS, e coli 배양액에서 정제한 재조합 GP 96, 또는 15 zero 종양 조직 세포에서 정제한 GP 96를 각각 펄스 처리하였습니다. 이후 이를 LG 15 성체 수용체에 입양 전달하였으며, 3일 후에 15 zero 종양 세포를 피하 주사로 이식하였습니다. 챌린지 후 며칠 뒤에 처음 나타난 종양을 모니터링하고 주기적으로 종양 크기를 측정하였습니다. 이 그래프에서 각 곡선은 개별 개구리의 종양 성장 역학을 나타냅니다. 결과에 따르면 0.5 µg 또는 1 µg의 GP 96로 프라이밍된 동물들은 대조군에 비해 종양 발생이 유의하게 지연되었습니다. 따라서 GP 96는 Xenopus에서 종양 항원의 교차 제시를 촉진합니다.지금까지 피부 이식 및 종양 이식 분석을 통해 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)에서 GP 96이 부항원과 종양 항원을 모두 제시하는 능력을 탐구하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 혈관이 손상된 경우에는 복강 세척액을 수집하지 않도록 주의해야 하는데, 이는 세포의 대부분이 대식세포가 아닌 적혈구이기 때문입니다. 또한 피부 이식편을 다룰 때 조직이 손상되지 않도록 포셉으로 조직을 세게 누르지 않는 것이 중요합니다.이상입니다. 세척해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

DA 쥐에서 만성 - 원래대로 돌아가는 실험 면역 encephalomyelitis :이 비디오는 여러 경화증의 동물 모델의 유도 및 임상 채점을 보여줍니다. 전체 쥐의 척수하고 완전한 프로 인드의 도움이되는가 포함된 유제와 immunizing 쥐가 유도된 질병은, 인간의 질병을 닮은 임상 징후를 보여줍니다.

유도 및 만성 - 원래대로 돌아가는 실험 면역 Encephalomyelitis 임상 채점

특정 마우스 변종은 myelin 기본 단백질과 함께 실험적인 면역 encephalomyelitis (EAE)의 유도에 저항 할 수 있습니다. 여기에서 설명한 것은 응답하지 않는 문제를 역으로 여러 전형 EAE 모성 마우스 얼룩에 중풍 질환을 유도하는 간단한 예방 접종 프로토콜입니다.

입양 이전 및 Antigenic 챌린지에 의해 실험적 면역 Encephalomyelitis (EAE) 모성 마우스 변종에 응답하지 않는 문제를 극복

이 비디오는 쥐 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유도하기 위해 항원 보조 에멀젼을 생성하는 효율적인 균질화 기술을 보여줍니다. 에멀젼은 물 상태에 자가항원인 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)을 함유하고 있으며, 불활성화된 병원성 박테리아로 구성된 연속적인 오일 상태로 둘러싸여 있습니다. 에멀젼은 장기적인 면역 반응을 위해 항원의 지속적인 방출을 보장합니다.

자가면역 뇌척수염을 유발하기 위한 항원 보조 에멀젼 제조

생존을 위해 필수적인 유전자 돌연변이 라인을 만들기 위한 기술 장애물 포즈. Leapfrogging 게놈 야생-타입 동물 생식 변이 들고 만드는 원시 생식 세포 이식으로 편집을 결합 하 여 치 사 율 circumvents. Leapfrogging 또한 F1 세대에서 null homozygous 돌연변이의 효율적인 생성을 허용합니다. 여기, 이식 단계는 보여 줍니다.

Xenopus 에 Leapfrogging CRISPR/Cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식

Xenopus tadpoles vivo에서 신경 시스템의 기능을 조사 하기 위해 독특한 플랫폼을 제공 합니다. 우리 생활에서 후 각 정보 처리를 평가 하는 방법론을 설명 Xenopus 애벌레 정상적인 양육 조건에서 또는 부상 후.

생활 Xenopus Tadpoles에 후 각 통로의 기능 평가

기니 돼지 PBMCs에 대 한 인터페론-감마 ELISpot 분석 결과 개발 전염병 연구이 관련성이 높은 모델 T 세포 응답의 특성을 수 있습니다. 우리는 DNA 백신의 피부 전달과와 관련 된 T 세포 응답을 측정 하는 분석 결과 적용 했습니다.

예방 접종 후 기니 돼지 모델에서 측정 T 세포 응답에 최적화 된 인터페론-감마 ELISpot 분석 결과

이 프로토콜은 DNA/DOTAP 혼합물을 1일 된 제노푸스 라에비스 배아의 안구에 미세 주입하는 방법과 지각 중뇌에서 광학 축색 아버를 발현하는 개별 녹색 형광 단백질(GFP)을 이미지화하고 재구성하는 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다. 그대로, 살아있는 제노푸스 올챙이.

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

이 프로토콜은 나노 에멀젼 오피오포고닌 D 보조제가 효과적인 세포 면역 반응을 촉진하는지 여부를 평가하기 위한 상세한 방법을 제시합니다.

체외 나노에멀젼 백신 보조제인 오피오포고닌 D의 세포 활성 평가

다발성 경화증의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하기 위해, 마우스를 자가항원 및 완전한 프로인트 보조제를 함유하는 유중수 에멀젼으로 면역화시킨다. 이러한 에멀젼의 제조를 위한 여러 프로토콜이 존재하지만, 에멀젼 제조를 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 프로토콜이 여기에 제시된다.

실험적 자가면역 뇌척수염 유도를 위한 항원/보조 에멀젼을 제조하기 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 방법

여기에 제시된 것은 전사체학 및 단백질체학 연구를 위해 아프리카 발톱 개구리의 조직 샘플을 준비하기 위한 효과적인 신속 혈액 관류 프로토콜입니다.

Xenopus의 효과적인 급속 관류

여기에서 우리는 열로 사멸된 Mycobacterium avium 아종 paratuberculosis를 포함하는 불완전한 Freund's adjuvant에 현탁된 면역원성 에피토프 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)35-55를 사용하여 C57BL/6 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 적극적으로 유도하는 대체 프로토콜을 제시합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염 동안 자가항원의 면역원성을 향상시키는 Mycobacterium paratuberculosis 의 보조 활성

학습하세요 Xenopus laevis에서 gp96이 항원 특이적 CD8 T 세포 반응을 촉진하는 역할을 면역학 연구에 활용하는 방법을. 이 기법은 피부 이식 거부 및 종양 면역 반응을 평가하는 데 유용합니다.

비교적 생체내에 학습 Xenopus laevis

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