0 조회수 • 3:18 분 • April 30th, 2023
- 먼저 마취된 쥐의 목을 잡고 눈을 내민다. 눈의 내측 안각에 미세한 모세혈관을 삽입합니다. 모세관 작용에 의해 혈액이 튜브로 흐르도록 합니다. 혈액을 EDTA 코팅된 튜브로 옮기고 얼음 위에 유지합니다. EDTA는 칼슘 이온과 결합하여 혈액 응고를 방지합니다. 온도가 낮으면 세포의 해당작용 활성이 감소하고 미생물 오염 가능성이 줄어듭니다.
다음으로 EDTA가 함유된 완충액으로 혈액을 희석하고 잘 섞는다. 혈액을 방해하지 않고 바닥에 적절한 분리 용액 층을 조심스럽게 추가하십시오. 서스펜션을 원심분리기합니다. 분리 용액의 고분자는 적혈구와 침전물을 바닥에 응집시킵니다. 단핵 세포와 혈소판은 고분자보다 가볍기 때문에 고분자 구배 위에 침전됩니다.
플라즈마를 포함하는 최상층을 제거하고 단핵 세포를 포함하는 불투명한 흰색 고리를 수집합니다. PBS와 원심분리기를 사용하여 세포를 희석하여 잔류 혈장과 혈소판을 제거합니다. 추가 분석을 위해 분리된 단핵 세포를 사용합니다. 다음 프로토콜은 백혈병 세포주 C1498을 주입한 선천성 마우스로부터 단핵 세포의 분리를 보여줍니다.
- 마취된 백혈병 동물의 눈의 내측 안각에 모세혈관을 삽입합니다.100-200마이크로리터의 혈액이 안와동에서 모세혈관으로 채취됩니다. 튜브를 제거하고 멸균 거즈 스펀지를 눈에 부드럽게 펴 발라 출혈을 조절합니다. 그런 다음 혈액을 EDTA 튜브로 옮기고 단핵 세포가 분리될 때까지 튜브를 얼음 위에 보관합니다.
혈액 단핵 세포를 분리하려면 먼저 1밀리몰 EDTA가 보충된 PBS를 최종 부피 500마이크로리터까지 추가합니다. 그런 다음 샘플을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 30게이지 바늘이 장착된 1ml 주사기를 사용하여 층이 섞이지 않도록 주의하면서 혈액 아래에 500마이크로리터의 분리 용액을 조심스럽게 겹쳐 놓습니다.
원심분리로 세포를 분리하고 피펫을 사용하여 불투명한 흰색 단핵 세포층을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 PBS 1ml로 면역 세포를 씻습니다. 이들을 원심분리하고 펠릿을 600마이크로리터의 FACS 완충액에 다시 현탁시켜 유세포 분석을 통한 염색 및 분석을 수행합니다.