0 조회수 • 4:39 분 • April 30th, 2023
- 세포외 플럭스 분석은 두 가지 주요 에너지 경로인 해당작용(glycolysis)과 미토콘드리아 호흡(mitochondrial respiration)을 측정하여 세포 대사를 연구하는 데 도움이 됩니다. 해당과정(glycolysis) 과정에서 세포는 포도당을 대사하고 젖산을 양성자와 함께 세포외 공간으로 분비하며, 이는 세포외 산성화율(Extracellular Acidification Rate, ECAR)을 측정하여 결정됩니다. 미토콘드리아 호흡 동안 세포는 산소 소비율(OCR)을 결정하여 측정된 ATP 생산을 위해 산소를 사용합니다.
암세포는 조절되지 않은 세포 증식에 적응하고 유지하기 위해 신진대사 속도를 변경하기 때문에 높은 포도당 흡수를 나타냅니다. 암세포의 대사를 분석하려면 먼저 부착성 암세포 단층과 수화 센서 카트리지가 포함된 플럭스 분석 마이크로플레이트를 조립합니다. 플레이트 어셈블리를 플럭스 분석기로 옮깁니다. 분석기 내에서 센서 프로브는 하강하여 일시적인 마이크로 챔버를 생성합니다. 세포 외 플럭스를 측정하기 위해 주입 포트는 사전 설정된 시점에서 테스트 화합물을 마이크로플레이트에 도입합니다.
세포 대사에 따라 사용 가능한 산소와 마이크로 챔버에서 방출되는 양성자의 농도가 변동합니다. 카트리지 바닥에 내장된 두 개의 형광단은 각각 미토콘드리아 호흡과 해당과정을 나타내는 산소와 양성자 수치를 동시에 감지하고 측정합니다. 다음 프로토콜에서는 1차 백혈병 세포의 대사 활성을 측정하기 위한 세포외 플럭스 분석을 시연합니다.
- 한편, 세포외 플럭스 분석을 위해 플레이트를 준비하기 위해 2개의 8웰 세포외 플럭스 분석기 플레이트의 각 웰에 12.5마이크로리터의 세포 접착 용액을 추가합니다. 20분 후 셀 접착제를 흡인하고 세척당 200마이크로리터의 멸균수로 각 웰을 두 번 세척합니다.
두 번째 세척 후 웰이 마를 때까지 플레이트를 후드에 그대로 두고 센서 카트리지를 실험실 벤치에 거꾸로 놓습니다. 플럭스 분석기의 유틸리티 플레이트와 센서 카트리지를 분리하고 유틸리티 플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 보정액을 채우고 웰 외부의 각 해자를 400마이크로리터의 보정제로 채웁니다.
센서 카트리지를 이제 교정제가 들어 있는 유틸리티 플레이트에 다시 넣고 카트리지 어셈블리를 CO2가 없는 섭씨 37도의 가습된 인큐베이터에 밤새 넣습니다. 그런 다음 세포외 플럭스 분석기를 켜고 밤새 섭씨 37도까지 데웁니다.
다음 날 아침, 원심분리를 위해 플라스크에서 50ml 원추형 튜브로 세포를 옮기고 계수를 위해 적절한 실험 배지 1ml에 펠릿을 재현탁합니다. 400 마이크로 리터의 실험 배지 농도에서 6 개의 세포를 4 배 10에서 현탁시키고 50 마이크로 리터의 세포를 플럭스 분석기 플레이트의 웰 B에서 G까지, 180 마이크로 리터의 실험 배지를 웰 A와 H에 배경 제어 웰로 추가합니다.
원심분리 후 130마이크로리터의 실험용 배지를 웰 B에서 G에 천천히 조심스럽게 첨가하고 현미경으로 각 웰의 바닥에 세포가 안정적으로 부착되어 있는지 육안으로 확인합니다. 그런 다음 플럭스 분석 플레이트를 CO2가 없는 가습된 섭씨 37도 인큐베이터에 30분 동안 다시 넣습니다.
배양이 끝나기 20분 전에 표에 표시된 대로 실험 프로토콜에 따라 화합물을 카트리지의 적절한 주입기 포트에 로드합니다. 그런 다음 적절한 세포 외 플럭스 분석 프로그램을 설정합니다. 프로그램을 시작하고 메시지가 표시되면 보정 플레이트를 분석 플레이트로 교체합니다.