0 조회수 • 3:57 분 • April 30th, 2023
- 림프구의 일종인 T세포는 감염과 싸우는 데 적극적인 역할을 한다. 다른 여러 혈액 세포 유형과 함께 면역 능력이 있는 T 세포는 쥐의 비장과 림프절에 존재합니다. T 세포를 선택적으로 분리하려면 쥐의 비장과 림프절을 채취하여 세포 여과기에 침용합니다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 적절한 배지로 조직을 세척합니다.
염화암모늄 칼륨 또는 ACK 완충액을 첨가하여 적혈구를 용해시킵니다. 용해물에서 온전한 혈액 세포를 분리하기 위한 원심분리기. 상등액을 버리고 적절한 완충액에 세포를 재현탁합니다. 과립구, B세포, NK 세포 및 남아 있는 적혈구와 같은 혈액 세포를 표적으로 하는 비오틴화된 항마우스 항체의 혼합물로 현탁액을 처리합니다. T 세포는 표적이 아니므로 태그가 지정되지 않은 상태로 남아 있습니다.
다음으로, 현탁액에 항비오틴 자성 마이크로비드를 추가합니다. 비오틴으로 표지된 모든 세포는 마이크로비드에 결합합니다. 강한 자기장의 영향을 받으면 자기적으로 표지된 셀이 튜브 벽에 부착됩니다. 표지되지 않은 T 세포는 부유 상태로 남아 있습니다. 결합되지 않은 농축 T 세포를 새로운 수집 튜브에 모읍니다. 다음 프로토콜에서는 자기 분리 기술을 사용하여 T 세포가 쥐의 비장과 림프절에서 분리되는 것을 보여줍니다.
- 림프절과 비장을 40마이크로미터 기공 여과기에 모으고 주사기 플런저를 사용하여 필터를 통해 조직을 침지하여 세포를 방출합니다. 1% FBS가 보충된 RPMI 배지로 스트레이너와 플런저를 세척하여 모든 세포를 수집하고 원심분리로 세포를 침전합니다. 5ml의 ACK 용해 완충액을 세포 펠릿에 추가합니다.
실온에서 5분 후 1% FBS가 보충된 5ml의 배지로 반응을 중지하고 원심분리로 백혈구를 펠렛화합니다. 계수를 위해 펠릿을 5밀리리터의 MACS 완충액에 재현탁하고 새로운 MACS 완충액에서 마이크로리터당 8개의 세포에 2배의 농도로 세포를 희석합니다. 6개 세포에 1 곱 10당 적절한 농도의 항적혈구, 항과립구, 항B세포, 항NK 세포 고갈 항체를 6개 세포에 첨가하여 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다.
배양이 끝나면 10mm의 얼음처럼 차가운 MACS 완충액으로 세포를 세척하고 새로운 MACS 완충액에서 10에서 밀리리터당 8세포 농도의 1배로 펠릿을 재현탁합니다. 다음으로, 1 x 10 당 0.22 μl의 항 비오틴 마이크로 비드를 섭씨 4도에서 15 분 배양을 위해 혼합하여 6 개의 세포에 첨가합니다.
배양이 끝나면 10ml의 얼음처럼 차가운 MACS 완충액으로 세포를 세척하고 표준 비드 분리 프로토콜에 따라 MACS 익스프레스 세퍼레이터를 사용하여 마그네틱 비드 분리를 통해 결합되지 않은 농축 T 세포를 수집합니다. 분리가 끝나면 원심분리로 T 세포를 침전하고 계수를 위해 5ml의 새로운 MACS 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.