DNA 안정 - 동위 원소 (DNA - SIP) 탐색

이 절차의 전반적인 목적은 실험실 배양이라는 전제 조건 없이, 특정 성장 기질을 소비한 활성 미생물로부터 DNA를 회수하는 것입니다. 이는 먼저 환경 시료를 천연 환경과 유사한 조건에서 안정 동위원소로 표지된 특정 기질과 함께 배양함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 이렇게 동위원소가 표지된 시료로부터 총 DNA를 추출하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 이 DNA를 염화세슘 밀도 구배 초원심분리에 회부하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 밀도 구배를 분획하여 이후의 분자적 특성 분석을 위한 무거운 DNA와 가벼운 DNA를 얻는 것입니다. 궁극적으로, 핑거프린팅, 마이크로어레이, 하이브리드 형성, 클론, 라이브러리 분석 및 메타게노믹스를 포함한 다양한 가능한 분자 기술을 통해 특정 기질의 대사에 관여하지만 아직 배양되지 않은 활성 미생물의 정체를 밝히는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 워털루 대학교 생물학과 교수 Josh Neufeld입니다. 저는 Neufeld 연구실의 대학원생 Eric Dunford입니다. 오늘은 미지의, 그리고 잠재적으로 배양이 불가능한 미생물의 정체와 특정 성장 기질의 이용 능력을 연관시키는 널리 사용되는 기술인 DNA 안정 동위원소 프로빙(DNA stable isotope probing, DNA SIP) 절차를 보여드리겠습니다.

Newfeld 연구실에서는 다양한 육상 및 수생 환경에서의 탄소원 대사를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 오늘은 특정 탄소 기질인 13 C glucose를 토양 샘플에 적용하는 방법을 보여드리겠습니다. 하지만 이 방법이 Warwick 대학교의 Colin Merle 연구팀에 의해 처음 개발된 이후, 연구자들이 이 프로토콜을 다양하게 발전시켜 여러 가지 다른 환경에 적용하고 질소나 산소와 같은 다양한 표지 동위원소를 사용해 왔음을 밝힙니다.

오늘은 탄소에 집중하겠지만, 프로토콜 자체는 다양한 실험 설계에 적용할 수 있습니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하기 전, 본 프로토콜의 서술 부분에 설명된 대로 모든 DNA 안정 동위원소 프로빙(DNA stable isotope probing) 또는 DNA CYP 시약을 준비하십시오.

DNAC는 시료 배양부터 시작합니다. 배양 조건은 시료 및 기질의 다양한 특성에 따라 매우 광범위하게 달라집니다. 경험적으로 적절한 배양 조건이 결정되면, 환경 시료에 적절한 기질 첨가제를 추가합니다.

테스트 배양 결과에 따라 미생물 성장에 필요한 경우 보충 영양제를 추가할 수도 있습니다. 샘플 배양 설정이 완료되면 샘플의 캡을 닫고 밀봉한 후, 표지된 기질이 포함된 환경 샘플을 배양합니다. 제시된 예시는 토양 샘플에 carbon 13 표지 포도당 용액을 첨가하는 과정입니다.

다음으로, 이후 단계에서 관찰되는 핵산의 표지가 명확한지 확인하기 위한 비교군으로서 대조군 배양을 설정합니다. 기질 캡으로 표지되지 않은 탄소를 사용하는 것 외에는 동일한 조건에서 이 시료를 준비하고, 동일한 조건에서 표지되지 않은 기질과 함께 환경 시료를 밀봉하여 배양합니다. 배양 후, 원하는 하위 응용 분야에 적합한 추출 프로토콜을 사용하여 마이크로코즘에서 DNA를 추출합니다. 그런 다음 아가로스 겔과 분광광도계를 사용하여 이후의 초원심분리 단계에 필요한 추출된 DNA의 양을 정량합니다.

경량 및 중량 DNA를 최대한으로 분리하기 위해 초원심분리에 수직 또는 거의 수직인 로터를 사용하십시오. Beckman Coulter VTI 65.2 로터에는 초원심분리용 샘플을 준비하기 위한 5.1 milliliter 퀵 씰 폴리머 튜브를 담을 수 있는 16개의 웰이 있습니다. 먼저, 초원심분리 튜브에 0.5에서 5 micrograms의 DNA를 첨가하는 데 필요한 추출된 DNA의 부피를 계산하십시오.

이전에 측정된 DNA 농도를 사용합니다. 그다음 디지털 굴절계를 사용하여 세슘 클로라이드(cesium chloride) 스톡 용액의 정확한 밀도를 측정합니다. 서면 프로토콜에 제시된 대로, 적절한 혼합 비율을 생성하는 데 필요한 그라이언트 버퍼 DNA 용액의 부피를 계산합니다.

이 계산 값을 사용하여, 추출된 DNA를 gradient buffer 및 4.8 milliliters의 cesium chloride와 함께 멸균 일회용 15 milliliter 튜브에 혼합합니다. 원심분리 튜브를 완전히 채우기 위해, 결과 부피는 원심분리 튜브의 명시된 용량보다 크게 설정합니다. 마지막으로 튜브를 10회 반전시켜 용액을 제조합니다.

튜브 내에서 DNA를 시각화할 수 있도록 구배 용액 내에 etBr 및 브로마이드와 같은 형광 물질을 사용하십시오. 여기에서 보여주는 것과 같이 AUM 브로마이드 구배를 포함하여 순수 배양 DNA로 준비할 때 DNA의 밀도를 변경하는 것은 각 원심분리 후 구배 형성을 즉각적으로 시각적 확인하는 데 특히 유용합니다. 이러한 접근 방식을 사용하는 단계별 과정은 서면 프로토콜에 기술되어 있습니다.

초원심분리 설정을 위해, 먼저 벌브와 파스퇴르 피펫을 사용하여 초원심분리 튜브에 밀도 구배 용액을 조심스럽게 채웁니다. 세밀한 유성 마커를 사용하여 튜브 어깨 부분에 라벨을 붙입니다. 튜브를 튜브 넥의 바닥 부분까지 정확하게 채워야 하며, 충분히 채우지 않은 튜브는 초원심분리 중에 파손될 가능성이 있습니다.

필요한 모든 튜브에 샘플 용액을 채운 후, 각 튜브의 정확한 질량을 기록하십시오. 튜브들을 가능한 한 질량이 일치하는 쌍으로 분류하고, 10 mg 이내로 균형이 맞을 때까지 용액의 양을 추가하거나 제거하십시오. 용액의 높이는 튜브의 표시선(base of the tube next)에 최대한 가깝게 유지하십시오. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 튜브 토퍼를 사용하여 튜브를 밀봉하십시오.

튜브를 뒤집어 적당한 압력을 가해 제대로 밀봉되었는지 확인하십시오. 초원심분리 전에 밀봉 후에도 균형이 맞는지 확인하기 위해 튜브의 무게를 다시 측정하십시오. 초원심분리 중에 튜브를 뚫을 수 있는 먼지나 이물질이 없는지 확인하기 위해 각 로터 웰을 주의 깊게 점검하십시오.

균형이 맞는 튜브 쌍을 서로 반대편에 배치하여 로터에 삽입하십시오. 초원심분리 과정에서 마커 라벨이 읽기 어려워질 수 있으므로 각 샘플의 로터 위치를 기록하십시오. 제조사의 지침에 따라 로터 웰을 주의 깊게 밀봉하십시오.

로터 웰을 밀봉한 후, 로터를 초원심분리기에 장착합니다. 초원심분리기 도어를 닫고 VTI 65.2 로터에 진공을 가합니다. 회전 속도는 44,100 RPM, 온도는 20 °C, 초원심분리 시간은 36~40시간으로 설정합니다.

진공 상태를 확인하고 최대 가속도를 선택한 후, 감속으로 인해 밀도 구배가 흐트러지지 않도록 브레이크를 끕니다. 초원심분리가 끝난 직후 로터를 조심스럽게 제거하십시오. 튜브 내의 밀도 구배가 깨지지 않도록 로터를 기울이거나 부딪히지 않게 주의하십시오.

마지막으로, 구배 분획을 위해 튜브를 조심스럽게 꺼냅니다. 분획 기술을 사용하여 초원심분리 튜브에서 DNA를 추출할 수 있습니다. 먼저, 충분한 양의 propofol blue 염료가 포함된 멸균 증류 및 탈이온수로 멸균된 60 milliliter 주사기를 채웁니다.

진한 파란색을 내기 위해, 시린지를 시린지 펌프의 로딩 암에 거치합니다. 그다음 23 gauge 1인치 바늘이 장착된 펌프 튜브를 연결하고, 바늘 끝으로 물이 나올 때까지 펌프를 작동시킵니다. 물 공급 장치 내에 기포가 생기면 분획 과정에 부정적인 영향을 미치므로 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.

각 시료당 시료 번호와 분획이 표시된 라벨을 부착한 멸균 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브 12개를 준비합니다. 그다음, 초원심분리 튜브 중 하나를 빠르고 정밀한 동작으로 클램프 스탠드에 고정합니다. 새 23 gauge 1 inch 바늘을 사용하여 튜브의 접합선을 따라 튜브 바닥을 뚫고, 바늘을 회전시켜 구멍이 균일하게 형성되었는지 확인합니다.

니트릴 장갑보다 라텍스 장갑이 바늘 축을 더 잘 잡을 수 있다는 것을 알 수 있습니다. 펌프 튜브에 연결된 바늘을 사용하여, 튜브 상단 어깨 부분의 이음선을 따라 빠르고 정확하게 튜브 윗부분을 찌릅니다. 튜브 윗부분을 먼저 찌른 후 아랫부분을 찌르는 방식으로도 수행할 수 있음에 유의하십시오.

또한, 튜브의 어깨 부분에 소량의 미네랄 오일을 도포하면 이전에 보정된 펌프 속도에서 상단 바늘 주변의 밀봉 불량으로 인한 누출을 방지하는 데 도움이 될 수 있음을 유의하십시오. 염색된 물을 튜브 상단으로 펌핑하여 12분 동안 425 µL 분획을 12개 생성합니다. 타이머를 사용하여 라벨이 부착된 마이크로 원심분리 튜브에 기울기 용액을 수집하십시오.

마지막으로, 최소 하나 이상의 샘플 또는 대조군 구배에 대해 모든 분획의 밀도를 확인합니다. 디지털 굴절계를 사용하십시오. 모든 분획에서 DNA를 침전시키기 위해서는 밀도 값이 1.690에서 1.760 g/mL 범위 내에 있어야 하며, 중앙값 밀도는 약 1.725 g/mL여야 합니다.

먼저, 침전용 캐리어로 선형 폴리아크릴아미드 20 micrograms를 첨가하고 뒤집어서 혼합합니다. 그다음 PEG 용액을 2배 부피로 첨가하고 다시 뒤집어서 혼합합니다. 인큐베이션 후 DNA가 침전될 수 있도록 튜브를 실온에서 2시간 동안 방치합니다.

펠렛의 위치를 일정하게 유지하기 위해 튜브가 모두 같은 방향을 향하도록 마이크로 원심분리기에 샘플을 넣습니다. 13,000 G에서 30분 동안 원심분리한 후, 마이크로 원심분리기에서 샘플을 꺼내어 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 이 단계에서는 밝은 광원을 이용하면 펠렛을 확인할 수 있어야 합니다.

원심분리 후 펠렛을 70% ethanol 500 µL로 세척하십시오. 샘플을 13,000 G에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하십시오. 이제 펠렛이 더 잘 보일 것이나, 튜브 벽에서 더 쉽게 떨어질 수 있습니다.

펠렛을 실온에서 15분 동안 건조합니다. 펠렛이 건조되면 각 펠렛을 50 µL의 TE buffer에 현탁합니다. 마지막으로, 서면 프로토콜에서 설명한 방법을 사용하여 기울기 분획의 특성을 분석하기 위해 각 분획 5 µL를 aeros gel에서 전기영동합니다.

일반적인 DNA SIP 결과는 초원심분리를 통한 기울기 형태로 표지된 DNA와 표지되지 않은 DNA의 분리가 나타납니다. 이상적으로는, 탄소 13 및 질소 15와 같은 고분자량 유전 물질이 표지되지 않은 물질로부터 완전히 분리되며, 특히 천연 기질이 아닌 안정 동위원소가 배양된 시료의 4번에서 8번 분획과 연관된 고유한 PCR 기반 핑거프린트가 나타나게 됩니다. 두 가지 순수 배양균인 탄소 13 표지 Methylococcus capsulatus strain Bath와 표지되지 않은 Sian medi A TCC 10 21의 DNA를 사용하여 수행한 배양 대조군은 특정 미생물과 특정 표지 기질의 대사 사이의 연관성을 보여주는 강력한 증거를 제공하며, 표지된 genomic DNA와 표지되지 않은 genomic DNA는 서로 다른 밀도를 가진 각각의 기울기 분획으로 분리됩니다.

이 예시에서 중이소토표지 DNA는 4번에서 5번 분획에서 관찰되는 반면, 표지되지 않은 DNA는 9번에서 10번 분획에서 고농도로 발견됩니다. 동일한 분획에서 PCR로 증폭된 DNA를 변성 및 구배 겔 전기영동(DGGE)으로 분석하여, 구배에 포함된 두 생물체에 해당하는 개별적인 밴딩 패턴을 생성하였습니다. 분획의 밀도는 약 1.580에서 1.759 g/mL 범위이며, 왼쪽에서 오른쪽으로 밀도가 감소하는 순서로 표시되어 있습니다.

반대로, 동위원소 분리와 환경 시료 배양은 해석이 더 어려울 수 있습니다. 캐나다 리졸루트 베이(Resolute Bay)의 툰드라 토양을 carbon 12 또는 carbon 13로 표지된 포도당과 함께 15 °C에서 14일 동안 배양하였습니다. 정제된 구배 분획 DNA의 에어로젤 분석 결과, carbon 12 및 carbon 13 배양군 모두 분획 7에서 10에 걸쳐 게놈 DNA 스미어(smear)가 나타났습니다.

하지만 특정 미생물 분류군의 바이오매스 내 탄소 13 농축도를 결정하기 위해 16 s ribosomal RNA 유전자의 DGGE를 이용했을 때, 탄소 12 글루코스를 배양한 토양의 DNA는 모든 구배 분획에서 유사한 패턴을 생성한 반면, 탄소 13 글루코스를 배양한 시료는 분획 5에서 8과 고유하게 연관된 DGGE 핑거프린트를 생성했으며, 화살표로 표시된 보존된 밴드는 모든 구배 분획에서 일관되게 나타나는 우점 phylo type을 나타냈습니다. 탄소 13 글루코스를 배양한 토양에서 얻은 DNA의 경우 phylo type이 더 무거운 분획으로 이동합니다. 이 특정 16 s ribosomal RNA 유전자의 정체를 규명함으로써 후속 메타게놈 또는 배양 기반 접근법의 지표로 삼을 수 있습니다.

지금까지 시료 배양부터 분자 분석을 위한 표지된 DNA 확보까지, DNA 안정 동위원소 프로빙 실험을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 실험 설계를 세심하게 고려하는 것이 중요하며, 특히 빠르게 성장하는 생물체 쪽으로 실험 결과가 편향되는 것을 방지하기 위해 기질을 너무 많이 첨가하지 않도록 주의해야 합니다. 또한, 먹이 그물을 통해 기질이 군집 내 다른 구성원들에게 희석되어 전달되지 않도록 배양 시간을 과도하게 늘리지 않는 것이 좋습니다.

따라서 민감한 PCR 기반 애플리케이션을 통해 중량 분획 내의 소량의 표지된 DNA를 검출하려면, 적절한 양의 기질과 충분한 배양 시간을 사용해야 합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.