Name: DNA 안정 - 동위 원소 (DNA - SIP) 탐색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-02T17:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 57 s
Description: 탐색하세요 DNA 안정 동위원소 탐색법을 통해 배양 없이 활성 미생물 군집을 식별하는 방법을 배우세요. 이 기술은 환경 미생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 전략적 프로젝트와 자연 과학 및 캐나다 공학 연구 협의회 (NSERC)에서 JDN로 디스커버리 기금에 의해 지원되었다.

<ol><li>Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).</li>
<li>Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-specific+clades+of+active+marine+methylotrophs+associated+with+a+phytoplankton+bloom+in+a+temperate+coastal+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a temperate coastal environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 7321-7328 (2009).</li>
<li>Nercessian, O., Noyes, E., Kalyuzhnaya, M. G., Lidstrom, M. E., Chistoserdova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+populations+active+in+metabolism+of+C1+compounds+in+the+sediment+of+Lake+Washington%2C+a+freshwater+lake%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington, a freshwater lake.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 6885-6899 (2005).</li>
<li>Padmanabhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiration+of+13C-labelled+substrates+added+to+soil+in+the+field+and+subsequent+16S+rRNA+gene+analysis+of+13C-labelled+soil+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Respiration of 13C-labelled substrates added to soil in the field and subsequent 16S rRNA gene analysis of 13C-labelled soil DNA.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1614-1622 (2003).</li>
<li>Bernard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+identification+of+soil+microbial+populations+actively+assimilating+carbon+from+13C-labelled+wheat+residue+as+estimated+by+DNA-+and+RNA-SIP+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics and identification of soil microbial populations actively assimilating carbon from 13C-labelled wheat residue as estimated by DNA- and RNA-SIP techniques.</a> Environ. Microbiol. 9, 752-764 (2007).</li>
<li>Haichar, elZ. ahar, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cellulolytic+bacteria+in+soil+by+stable+isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of cellulolytic bacteria in soil by stable isotope probing.</a> Environ. Microbiol. 9, 625-634 (2007).</li>
<li>Addison, S., McDonald, I., Lloyd-Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing%3A+Technical+considerations+when+resolving+15N-labelled+RNA+in+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing: Technical considerations when resolving 15N-labelled RNA in gradients.</a> J. Microbiol. Meth. 80, 70-75 (2009).</li>
<li>Buckley, D. H., Huangyutitham, V., Hsu, S. -F., Nelson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing+with+15N+achieved+by+disentangling+the+effects+of+genome+G+%2B+C+content+and+isotope+enrichment+on+DNA+density%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing with 15N achieved by disentangling the effects of genome G + C content and isotope enrichment on DNA density.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 3189-3195 (2007).</li>
<li>Schwartz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+growing+microorganisms+in+soil+by+stable+isotope+probing+with+H218O%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of growing microorganisms in soil by stable isotope probing with H218O.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 2541-2546 (2007).</li>
<li>Neufeld, J. D., Dumont, M. G., Vohra, J., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+for+the+use+of+stable+isotope+probing+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations for the use of stable isotope probing in microbial ecology.</a> Microb. Ecol. 53, 435-442 (2007).</li>
<li>Martineau, C., Whyte, L., Greer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+SYBR+safe+technique+for+the+sensitive+detection+of+DNA+in+cesium+chloride+density+gradients+for+stable+isotope+probing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Development of a SYBR safe technique for the sensitive detection of DNA in cesium chloride density gradients for stable isotope probing assays.</a> J. Microbiol. Meth. 73, 199-202 (2008).</li>
<li>Bartram, A. K., Poon, C., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+contamination+of+glycogen+used+in+nucleic+acid+precipitation+and+assessment+of+linear+polyacrylamide+as+an+alternative+co-precipitant%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid contamination of glycogen used in nucleic acid precipitation and assessment of linear polyacrylamide as an alternative co-precipitant.</a> Biotechniques. 47, 1019-1022 (2009).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+uncultivated+majority%3A+combining+DNA+stable-isotope+probing%2C+multiple+displacement+amplification+and+metagenomic+analyses+of+uncultivated+Methylocystis+in+acidic+peatlands%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Revealing the uncultivated majority: combining DNA stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomic analyses of uncultivated Methylocystis in acidic peatlands.</a> Environ. Microbiol. 10, 2609-2622 (2008).</li>
<li>Neufeld, J. D., Chen, Y., Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+methylotrophs+revealed+by+stable-isotope+probing%2C+multiple+displacement+amplification+and+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Marine methylotrophs revealed by stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomics.</a> Environ. Microbiol. 10, 1526-1535 (2008).</li>
<li>Kalyuzhnaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+metagenomics+targets+specific+functional+types+in+complex+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-resolution metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1029-1034 (2008).</li>
<li>Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Something+from+%28almost%29+nothing%3A+the+impact+of+multiple+displacement+amplification+on+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology.</a> ISME J. 2, 233-241 (2008).</li>
<li>Green, S. J., Leigh, M. B., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+SJ+%22Microbiology+of+Hydrocarbon+and+Lipid+Microbiology%22">Microbiology of Hydrocarbon and Lipid Microbiology</a>. Timmis, K. N. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 4137-4158 (2010).</li>
<li>Neufeld, J. D., Wagner, M., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Who+eats+what%2C+where+and+when%3F+Isotope-labelling+experiments+are+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Who eats what, where and when? Isotope-labelling experiments are coming of age.</a> ISME J. 1, 103-110 (2007).</li>
<li>Gallagher, E., McGuinness, L., Phelps, C., Young, L. Y., Kerkhof, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+shortens+the+incubation+time+needed+to+detect+benzoate-utilizing+denitrifying+bacteria+by+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">DNA shortens the incubation time needed to detect benzoate-utilizing denitrifying bacteria by stable-isotope probing.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 5192-5196 Forthcoming.</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

안정 동위 원소 탐색 - 실험의 적절한 설계 배경 unlabelled 사회 위의 레이블 DNA를 얻기 위해 매우 중요합니다. 부화 시간, 기판 농도, 배양 조건 (예 : 영양분, 토양 수분 함량), 교차 수유와 복제를 샘플에 관련된 고려 사항은 다른 10,18 논의와 우리는 SIP 부화를 디자인할 때 독자가이 간행물을 참조하는 것이 좋습니다되었습니다. 현재 프로토콜에 관련된, 그것은 SIP 그라디언트에서 데이터의 해석과 관련된 추가적인 고려 사항에 대해 아무런 언급을 가치가있다. ultracentrifugation 과정의 특성으로 인해, 특히 분수에 표시하거나 사라지는 밴드는 프로토콜 자체의 유물되지 않도록하기 위해 순수 문화와 네이티브 기판 incubated 샘플로 컨트롤을 포함하는 또한 중요하다. 예를 들어, 초원 심 분리기 기울기 내의 DNA는 아가로 오스 겔 (그림 2A)에 표시되지 않을 수 있지만, 여전히 그라디언트의 전체 길이 (그림 2B)을 오염시킬 수 있습니다. 하지만 M. capsul...

<table><tbody><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP115-25</td><td></td></tr><tr><td>염화 세슘(Cesium chloride)</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP210-500</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(Ethanol), 시약급</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>652261</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드(Ethidium bromide)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>염산(Hydrochloric acid)</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>351285212</td><td></td></tr><tr><td>선형 폴리아크릴아마이드(Linear polyacrylamide)</td><td>시약</td><td>Applichem</td><td>A6587</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 6000(Polyethylene Glycol 6000)</td><td>시약</td><td>VWR international</td><td>CAPX1286L-4</td><td></td></tr><tr><td>염화 칼륨(Potassium Chloride)</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42409-0010</td><td></td></tr><tr><td>염화 나트륨(Sodium Chloride)</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2711</td><td></td></tr><tr><td>수산화 나트륨 펠릿(Sodium Hydroxide pellets)</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3181</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Dark Reader</td><td>장비</td><td>Clare Chemical</td><td>DR46B</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기(Microcentrifuge)</td><td>장비</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>장비</td><td>Fisher Scientific</td><td>361013650</td><td></td></tr><tr><td>주입 펌프(Infusion pump)</td><td>장비</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>N/A</td><td>모델 번호: BSP&lt;br/&gt;주문 상세 내용은 &lt;a href=&quot;http://www.braintreesci.com">www.braintreesci.com&lt;/a&gt;를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>튜브 실러(Tube sealer)</td><td>장비</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>358312</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기(Ultracentrifuge)</td><td>장비</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 로터(Ultracentrifuge rotor)</td><td>장비</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362754</td><td></td></tr><tr><td>자외선 광원(Ultraviolet light source)</td><td>장비</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0017-09</td><td>모든 UV 광원 사용 가능</td></tr><tr><td>자외선 차단 안면 보호구(Ultraviolet light face shield)</td><td>장비</td><td>Fisher Scientific</td><td>114051C</td><td></td></tr><tr><td>부틸 고무 스토퍼, 회색(Butyl rubber stoppers, gray)</td><td>재료</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27232</td><td></td></tr><tr><td>원심분리 튜브(Centrifuge tubes)</td><td>재료</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>342412</td><td></td></tr><tr><td>피하 주사 바늘, 23 gauge, 길이 2&amp;#8221;</td><td>재료</td><td>BD Biosciences</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 튜브, 1.5 mL</td><td>재료</td><td>DiaMed</td><td>AD151-N500</td><td></td></tr><tr><td>개방형 센터 씰, 직경 20 mm(Open center seals, 20 mm diameter)</td><td>재료</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27230-U</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫, 유리제(Pasteur pipettes, glass)</td><td>재료</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6C</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁(Pipet tips)</td><td>재료</td><td>DiaMed</td><td>BPS340-1000</td><td>카탈로그 번호는 200 &amp;#x03BC;l 팁 기준입니다. 10 또는 20 &amp;#x03BC;l 팁도 동일한 공급처에서 구매할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>펌프 튜브, 내경 1.5 mm x 벽 두께 1.5 mm</td><td>재료</td><td>Appleton Woods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스크류 캡 튜브, 15 mL</td><td>재료</td><td>DiaMed</td><td>AD15MLP-S</td><td></td></tr><tr><td>혈청 바이알, 용량 125 mL</td><td>재료</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z114014</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 60 mL</td><td>재료</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td></td></tr></tbody></table>

dna 안정 - 동위 원소 (dna - sip) 탐색

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA 안정 - 동위 원소 (DNA - SIP) 프로빙 세포 바이오 매스로 특정 탄소 기판과 영양소 동화 활성 미생물을 식별을위한 강력한 기법입니다. 따라서,이 재배 독립적인 기술은 지상파 및 수생 환경에서 광범위한 거주 다양한 커뮤니티에 신진 대사 기능을 할당을위한 중요한 방법론을했습니다. 안정 동위 원소 - 라벨 화합물과 환경 샘플의 부화에 따라 추출 핵산은 다양한 밀도의 핵산을 분리하는 밀도 기울기 ultracentrifugation 이후 기울기 분별 (분리)를 받게됩니다. 세슘 염화에서 DNA의 정화는 이후 분자 특성 (예 : 지문, microarrays, 클론 라이브러리, metagenomics)의 DNA를 표시하고 unlabelled 검색합니다. 이 조브 비디오 프로토콜은 밀도 기울기 ultracentrifugation, 그라데이션 분류 및 라벨 DNA의 복구를위한 프로토콜의 시각을 단계별로 설명을 제공합니다. 프로토콜은 샘플 SIP 데이터와 하이라이트 중요한 팁을 포함하고 성공 DNA - SIP 분석을 보장하기 위해 고려되어야한다는주의.

DNA 안정 - 동위 원소 탐색 특정 기판을 활용 능력이 미생물의 활성 커뮤니티를 식별하고 특징을 재배 독립 방법입니다. 무거운 동위 원소의 농축 기판의 동화는 미생물 바이오 매스로 분류 원자의 결합에 이르게한다. 밀도 기울기 ultracentrifugation은 하류 분자 분석을위한 DNA 라벨을 검색합니다.

DNA 안정 - 동위 원소 (DNA - SIP) 탐색

DNA 안정 동위원소 탐침법(DNA-SIP)은 특정 탄소 기질을 동화하는 활성 미생물을 식별하는 강력한 기술이며...

이 절차의 전반적인 목적은 실험실 배양이라는 전제 조건 없이, 특정 성장 기질을 소비한 활성 미생물로부터 DNA를 회수하는 것입니다. 이는 먼저 환경 시료를 천연 환경과 유사한 조건에서 안정 동위원소로 표지된 특정 기질과 함께 배양함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 이렇게 동위원소가 표지된 시료로부터 총 DNA를 추출하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 이 DNA를 염화세슘 밀도 구배 초원심분리에 회부하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 밀도 구배를 분획하여 이후의 분자적 특성 분석을 위한 무거운 DNA와 가벼운 DNA를 얻는 것입니다. 궁극적으로, 핑거프린팅, 마이크로어레이, 하이브리드 형성, 클론, 라이브러리 분석 및 메타게노믹스를 포함한 다양한 가능한 분자 기술을 통해 특정 기질의 대사에 관여하지만 아직 배양되지 않은 활성 미생물의 정체를 밝히는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 워털루 대학교 생물학과 교수 Josh Neufeld입니다. 저는 Neufeld 연구실의 대학원생 Eric Dunford입니다. 오늘은 미지의, 그리고 잠재적으로 배양이 불가능한 미생물의 정체와 특정 성장 기질의 이용 능력을 연관시키는 널리 사용되는 기술인 DNA 안정 동위원소 프로빙(DNA stable isotope probing, DNA SIP) 절차를 보여드리겠습니다.Newfeld 연구실에서는 다양한 육상 및 수생 환경에서의 탄소원 대사를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 오늘은 특정 탄소 기질인 13 C glucose를 토양 샘플에 적용하는 방법을 보여드리겠습니다. 하지만 이 방법이 Warwick 대학교의 Colin Merle 연구팀에 의해 처음 개발된 이후, 연구자들이 이 프로토콜을 다양하게 발전시켜 여러 가지 다른 환경에 적용하고 질소나 산소와 같은 다양한 표지 동위원소를 사용해 왔음을 밝힙니다.오늘은 탄소에 집중하겠지만, 프로토콜 자체는 다양한 실험 설계에 적용할 수 있습니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하기 전, 본 프로토콜의 서술 부분에 설명된 대로 모든 DNA 안정 동위원소 프로빙(DNA stable isotope probing) 또는 DNA CYP 시약을 준비하십시오.DNAC는 시료 배양부터 시작합니다. 배양 조건은 시료 및 기질의 다양한 특성에 따라 매우 광범위하게 달라집니다. 경험적으로 적절한 배양 조건이 결정되면, 환경 시료에 적절한 기질 첨가제를 추가합니다.테스트 배양 결과에 따라 미생물 성장에 필요한 경우 보충 영양제를 추가할 수도 있습니다. 샘플 배양 설정이 완료되면 샘플의 캡을 닫고 밀봉한 후, 표지된 기질이 포함된 환경 샘플을 배양합니다. 제시된 예시는 토양 샘플에 carbon 13 표지 포도당 용액을 첨가하는 과정입니다.다음으로, 이후 단계에서 관찰되는 핵산의 표지가 명확한지 확인하기 위한 비교군으로서 대조군 배양을 설정합니다. 기질 캡으로 표지되지 않은 탄소를 사용하는 것 외에는 동일한 조건에서 이 시료를 준비하고, 동일한 조건에서 표지되지 않은 기질과 함께 환경 시료를 밀봉하여 배양합니다. 배양 후, 원하는 하위 응용 분야에 적합한 추출 프로토콜을 사용하여 마이크로코즘에서 DNA를 추출합니다. 그런 다음 아가로스 겔과 분광광도계를 사용하여 이후의 초원심분리 단계에 필요한 추출된 DNA의 양을 정량합니다.경량 및 중량 DNA를 최대한으로 분리하기 위해 초원심분리에 수직 또는 거의 수직인 로터를 사용하십시오. Beckman Coulter VTI 65.2 로터에는 초원심분리용 샘플을 준비하기 위한 5.1 milliliter 퀵 씰 폴리머 튜브를 담을 수 있는 16개의 웰이 있습니다. 먼저, 초원심분리 튜브에 0.5에서 5 micrograms의 DNA를 첨가하는 데 필요한 추출된 DNA의 부피를 계산하십시오.이전에 측정된 DNA 농도를 사용합니다. 그다음 디지털 굴절계를 사용하여 세슘 클로라이드(cesium chloride) 스톡 용액의 정확한 밀도를 측정합니다. 서면 프로토콜에 제시된 대로, 적절한 혼합 비율을 생성하는 데 필요한 그라이언트 버퍼 DNA 용액의 부피를 계산합니다.이 계산 값을 사용하여, 추출된 DNA를 gradient buffer 및 4.8 milliliters의 cesium chloride와 함께 멸균 일회용 15 milliliter 튜브에 혼합합니다. 원심분리 튜브를 완전히 채우기 위해, 결과 부피는 원심분리 튜브의 명시된 용량보다 크게 설정합니다. 마지막으로 튜브를 10회 반전시켜 용액을 제조합니다.튜브 내에서 DNA를 시각화할 수 있도록 구배 용액 내에 etBr 및 브로마이드와 같은 형광 물질을 사용하십시오. 여기에서 보여주는 것과 같이 AUM 브로마이드 구배를 포함하여 순수 배양 DNA로 준비할 때 DNA의 밀도를 변경하는 것은 각 원심분리 후 구배 형성을 즉각적으로 시각적 확인하는 데 특히 유용합니다. 이러한 접근 방식을 사용하는 단계별 과정은 서면 프로토콜에 기술되어 있습니다.초원심분리 설정을 위해, 먼저 벌브와 파스퇴르 피펫을 사용하여 초원심분리 튜브에 밀도 구배 용액을 조심스럽게 채웁니다. 세밀한 유성 마커를 사용하여 튜브 어깨 부분에 라벨을 붙입니다. 튜브를 튜브 넥의 바닥 부분까지 정확하게 채워야 하며, 충분히 채우지 않은 튜브는 초원심분리 중에 파손될 가능성이 있습니다.필요한 모든 튜브에 샘플 용액을 채운 후, 각 튜브의 정확한 질량을 기록하십시오. 튜브들을 가능한 한 질량이 일치하는 쌍으로 분류하고, 10 mg 이내로 균형이 맞을 때까지 용액의 양을 추가하거나 제거하십시오. 용액의 높이는 튜브의 표시선(base of the tube next)에 최대한 가깝게 유지하십시오. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 튜브 토퍼를 사용하여 튜브를 밀봉하십시오.튜브를 뒤집어 적당한 압력을 가해 제대로 밀봉되었는지 확인하십시오. 초원심분리 전에 밀봉 후에도 균형이 맞는지 확인하기 위해 튜브의 무게를 다시 측정하십시오. 초원심분리 중에 튜브를 뚫을 수 있는 먼지나 이물질이 없는지 확인하기 위해 각 로터 웰을 주의 깊게 점검하십시오.균형이 맞는 튜브 쌍을 서로 반대편에 배치하여 로터에 삽입하십시오. 초원심분리 과정에서 마커 라벨이 읽기 어려워질 수 있으므로 각 샘플의 로터 위치를 기록하십시오. 제조사의 지침에 따라 로터 웰을 주의 깊게 밀봉하십시오.로터 웰을 밀봉한 후, 로터를 초원심분리기에 장착합니다. 초원심분리기 도어를 닫고 VTI 65.2 로터에 진공을 가합니다. 회전 속도는 44,100 RPM, 온도는 20 °C, 초원심분리 시간은 36~40시간으로 설정합니다.진공 상태를 확인하고 최대 가속도를 선택한 후, 감속으로 인해 밀도 구배가 흐트러지지 않도록 브레이크를 끕니다. 초원심분리가 끝난 직후 로터를 조심스럽게 제거하십시오. 튜브 내의 밀도 구배가 깨지지 않도록 로터를 기울이거나 부딪히지 않게 주의하십시오.마지막으로, 구배 분획을 위해 튜브를 조심스럽게 꺼냅니다. 분획 기술을 사용하여 초원심분리 튜브에서 DNA를 추출할 수 있습니다. 먼저, 충분한 양의 propofol blue 염료가 포함된 멸균 증류 및 탈이온수로 멸균된 60 milliliter 주사기를 채웁니다.진한 파란색을 내기 위해, 시린지를 시린지 펌프의 로딩 암에 거치합니다. 그다음 23 gauge 1인치 바늘이 장착된 펌프 튜브를 연결하고, 바늘 끝으로 물이 나올 때까지 펌프를 작동시킵니다. 물 공급 장치 내에 기포가 생기면 분획 과정에 부정적인 영향을 미치므로 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.각 시료당 시료 번호와 분획이 표시된 라벨을 부착한 멸균 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브 12개를 준비합니다. 그다음, 초원심분리 튜브 중 하나를 빠르고 정밀한 동작으로 클램프 스탠드에 고정합니다. 새 23 gauge 1 inch 바늘을 사용하여 튜브의 접합선을 따라 튜브 바닥을 뚫고, 바늘을 회전시켜 구멍이 균일하게 형성되었는지 확인합니다.니트릴 장갑보다 라텍스 장갑이 바늘 축을 더 잘 잡을 수 있다는 것을 알 수 있습니다. 펌프 튜브에 연결된 바늘을 사용하여, 튜브 상단 어깨 부분의 이음선을 따라 빠르고 정확하게 튜브 윗부분을 찌릅니다. 튜브 윗부분을 먼저 찌른 후 아랫부분을 찌르는 방식으로도 수행할 수 있음에 유의하십시오.또한, 튜브의 어깨 부분에 소량의 미네랄 오일을 도포하면 이전에 보정된 펌프 속도에서 상단 바늘 주변의 밀봉 불량으로 인한 누출을 방지하는 데 도움이 될 수 있음을 유의하십시오. 염색된 물을 튜브 상단으로 펌핑하여 12분 동안 425 µL 분획을 12개 생성합니다. 타이머를 사용하여 라벨이 부착된 마이크로 원심분리 튜브에 기울기 용액을 수집하십시오.마지막으로, 최소 하나 이상의 샘플 또는 대조군 구배에 대해 모든 분획의 밀도를 확인합니다. 디지털 굴절계를 사용하십시오. 모든 분획에서 DNA를 침전시키기 위해서는 밀도 값이 1.690에서 1.760 g/mL 범위 내에 있어야 하며, 중앙값 밀도는 약 1.725 g/mL여야 합니다.먼저, 침전용 캐리어로 선형 폴리아크릴아미드 20 micrograms를 첨가하고 뒤집어서 혼합합니다. 그다음 PEG 용액을 2배 부피로 첨가하고 다시 뒤집어서 혼합합니다. 인큐베이션 후 DNA가 침전될 수 있도록 튜브를 실온에서 2시간 동안 방치합니다.펠렛의 위치를 일정하게 유지하기 위해 튜브가 모두 같은 방향을 향하도록 마이크로 원심분리기에 샘플을 넣습니다. 13,000 G에서 30분 동안 원심분리한 후, 마이크로 원심분리기에서 샘플을 꺼내어 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 이 단계에서는 밝은 광원을 이용하면 펠렛을 확인할 수 있어야 합니다.원심분리 후 펠렛을 70% ethanol 500 µL로 세척하십시오. 샘플을 13,000 G에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하십시오. 이제 펠렛이 더 잘 보일 것이나, 튜브 벽에서 더 쉽게 떨어질 수 있습니다.펠렛을 실온에서 15분 동안 건조합니다. 펠렛이 건조되면 각 펠렛을 50 µL의 TE buffer에 현탁합니다. 마지막으로, 서면 프로토콜에서 설명한 방법을 사용하여 기울기 분획의 특성을 분석하기 위해 각 분획 5 µL를 aeros gel에서 전기영동합니다.일반적인 DNA SIP 결과는 초원심분리를 통한 기울기 형태로 표지된 DNA와 표지되지 않은 DNA의 분리가 나타납니다. 이상적으로는, 탄소 13 및 질소 15와 같은 고분자량 유전 물질이 표지되지 않은 물질로부터 완전히 분리되며, 특히 천연 기질이 아닌 안정 동위원소가 배양된 시료의 4번에서 8번 분획과 연관된 고유한 PCR 기반 핑거프린트가 나타나게 됩니다. 두 가지 순수 배양균인 탄소 13 표지 Methylococcus capsulatus strain Bath와 표지되지 않은 Sian medi A TCC 10 21의 DNA를 사용하여 수행한 배양 대조군은 특정 미생물과 특정 표지 기질의 대사 사이의 연관성을 보여주는 강력한 증거를 제공하며, 표지된 genomic DNA와 표지되지 않은 genomic DNA는 서로 다른 밀도를 가진 각각의 기울기 분획으로 분리됩니다.이 예시에서 중이소토표지 DNA는 4번에서 5번 분획에서 관찰되는 반면, 표지되지 않은 DNA는 9번에서 10번 분획에서 고농도로 발견됩니다. 동일한 분획에서 PCR로 증폭된 DNA를 변성 및 구배 겔 전기영동(DGGE)으로 분석하여, 구배에 포함된 두 생물체에 해당하는 개별적인 밴딩 패턴을 생성하였습니다. 분획의 밀도는 약 1.580에서 1.759 g/mL 범위이며, 왼쪽에서 오른쪽으로 밀도가 감소하는 순서로 표시되어 있습니다.반대로, 동위원소 분리와 환경 시료 배양은 해석이 더 어려울 수 있습니다. 캐나다 리졸루트 베이(Resolute Bay)의 툰드라 토양을 carbon 12 또는 carbon 13로 표지된 포도당과 함께 15 °C에서 14일 동안 배양하였습니다. 정제된 구배 분획 DNA의 에어로젤 분석 결과, carbon 12 및 carbon 13 배양군 모두 분획 7에서 10에 걸쳐 게놈 DNA 스미어(smear)가 나타났습니다.하지만 특정 미생물 분류군의 바이오매스 내 탄소 13 농축도를 결정하기 위해 16 s ribosomal RNA 유전자의 DGGE를 이용했을 때, 탄소 12 글루코스를 배양한 토양의 DNA는 모든 구배 분획에서 유사한 패턴을 생성한 반면, 탄소 13 글루코스를 배양한 시료는 분획 5에서 8과 고유하게 연관된 DGGE 핑거프린트를 생성했으며, 화살표로 표시된 보존된 밴드는 모든 구배 분획에서 일관되게 나타나는 우점 phylo type을 나타냈습니다. 탄소 13 글루코스를 배양한 토양에서 얻은 DNA의 경우 phylo type이 더 무거운 분획으로 이동합니다. 이 특정 16 s ribosomal RNA 유전자의 정체를 규명함으로써 후속 메타게놈 또는 배양 기반 접근법의 지표로 삼을 수 있습니다.지금까지 시료 배양부터 분자 분석을 위한 표지된 DNA 확보까지, DNA 안정 동위원소 프로빙 실험을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 실험 설계를 세심하게 고려하는 것이 중요하며, 특히 빠르게 성장하는 생물체 쪽으로 실험 결과가 편향되는 것을 방지하기 위해 기질을 너무 많이 첨가하지 않도록 주의해야 합니다. 또한, 먹이 그물을 통해 기질이 군집 내 다른 구성원들에게 희석되어 전달되지 않도록 배양 시간을 과도하게 늘리지 않는 것이 좋습니다.따라서 민감한 PCR 기반 애플리케이션을 통해 중량 분획 내의 소량의 표지된 DNA를 검출하려면, 적절한 양의 기질과 충분한 배양 시간을 사용해야 합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리가 직접 라벨 형광 프로브를 사용하여 3D DNA 물고기에 의해 핵 구조를 분석하기위한 강력하고 다양한 프로토콜을 설명합니다.

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

스포 도프 테라 리토 랄리스의 가트와 연관된 활성 박테리아 여행자는 pyrosequencing 기법에 결합 안정 동위체 프로빙 (SIP)에 의해 결정되었다. 이 방법을 사용하여, 지역 사회 내에서 대사 활성 박테리아 종의 식별은 높은 해상도와 정밀도로 이루어졌다.

제너럴의 장내 대사 활성 박테리아의 식별<em&gt; 스포 도프 테라 리토 랄</em&gt; DNA 안정 동위 원소를 통해 사용 프로빙<sup&gt; 13</sup&gt; C-포도당

교정 하는 DNA 중 합 효소와 DNA 수리 분석 결과 대 한 비 표시, 라디오 동위-방법 고해상도 TOF MALDI 질량 분석 및 단일 뉴클레오티드 확장 전략을 사용 하 여 개발 되었다. 분석 결과 매우 특정, 간단 하, 빠른, 고 교정에 대 한 수행 하 여 복구 패치 9-뉴클레오티드 보다 짧은 입증 했다.

교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여

이 문서 T4 결 찰 및 어 닐 링 작은 원형 DNA 분자의 변성 페이지 정화에 대 한 상세한 프로토콜을 제시 하 고 원형 타일, 조립 및 1d 및 2D DNA nanostructures agarose의 AFM 이미지의 기본 페이지 분석 젤 유한 DNA nanostructures의 전기 및 원심 분리 정화입니다.

안정적인 DNA 모티프, 1d와 2D Nanostructures 작은 원형 DNA 분자에서 건설

이 논문은 DNA 기반 장력 프로브를 사용하여 면역 세포에 의해 가해지는 수용체 힘을 이미지화하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 접근법은 수용체 힘&gt;4.7pN을 실시간으로 매핑할 수 있으며 시간이 지남에 따라 힘을 통합할 수 있습니다.

면역 세포에 의한 일시적인 피코네톤 수용체 힘을 매핑하는 DNA 장력 프로브

D-루프 포획(DLC) 및 D-루프 확장(DLE) 분석은 정량적 PCR과 함께 근접 결찰 원리를 활용하여 사카로마이세스 세레비시아에서 유도성 이중 가닥 절단 부위에서 D-루프 형성, D-루프 확장 및 생성물 형성을 정량화합니다.

사카로마이세스 세레비시아에서 근접 결찰 및 정량적 PCR을 통한 상동 재조합 중간체의 검출

이 프로토콜은 돌연변이 프로파일링 실험을 위해 디메틸 설페이트로 RNA를 변형하기 위한 지침을 제공합니다. 여기에는 두 가지 대체 라이브러리 준비 방법을 사용한 시험관 내 및 생체 내 프로빙이 포함됩니다.

디메틸 설페이트를 사용한 RNA 구조 프로빙 시험관 내 및 세포에서 시퀀싱을 사용한 돌연변이 프로파일링

단백질 관련 신생 DNA의 풍부화 및 시퀀싱(eSPAN)은 두 개의 복제 DNA 가닥에서 염색질 관련 단백질의 상대적 풍부도를 검출하기 위해 개발되었으며, 이를 통해 염색질 복제와 그 결합 과정에 대한 분자적 통찰을 밝혀냈습니다. 이 프로토콜은 효모 및 마우스 배아 줄기(ES) 세포에서의 eSPAN 절차를 설명합니다.

단백질 관련 신생 DNA 농축 및 시퀀싱을 통한 DNA 복제 가닥 단백질의 가닥 특이적 분석

이 프로토콜은 형광 현미경 기반 단일 분자 DNA 복제 분석의 개요를 설명하여 DNA 중합효소와 G-4중 구조와 같은 장애물 간의 상호 작용을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

G-Quadruplexes에서 DNA 중합효소 역학의 단일 분자 형광 시각화

이 비디오에서는, 우리는 인간의 배아 줄기 세포의 mitochondrial 호흡 체인 단지가 겔 활동 assays 사용하여 분석할 수있는 방법을 보여줍니다.

인간 배아 줄기 세포에서 Mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색

탐색하세요 DNA 안정 동위원소 탐색법을 통해 배양 없이 활성 미생물 군집을 식별하는 방법을 배우세요. 이 기술은 환경 미생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

DNA 안정 - 동위 원소 (DNA - SIP) 탐색

더 많은 동영상 탐색