DNA 안정 - 동위 원소 (DNA - SIP) 탐색

이 절차의 전반적인 목표는 실험실 배양의 전제 조건 없이 관심 성장 기질을 소비한 활성 미생물에서 DNA를 회수하는 것입니다. 이는 먼저 자연 환경에서 발견되는 것과 유사한 조건에서 관심 있는 안정 동위원소로 표시된 기질이 있는 환경 샘플을 배양함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 이 동위원소로 표지된 샘플에서 총 DNA를 추출하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 이 DNA를 염화세슘에서 밀도 구배 초원심분리에 적용하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 밀도 구배를 분획하여 후속 분자 특성 분석을 위해 무거운 DNA와 가벼운 DNA를 얻는 것입니다. 궁극적으로, 지문 분석, 마이크로어레이, 혼성화, 클론, 라이브러리 분석 및 균유전체학(metagenomics)을 포함한 다양한 가능한 분자 기술을 통해 특정 기질의 대사에 관여하는 활동적이지만 배양되지 않은 미생물의 정체를 밝히는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 워털루 대학교 생물학과의 조쉬 뉴펠드(Josh Neufeld)입니다. 저는 뉴펠드 연구소의 대학원생인 에릭 던포드입니다. 오늘 우리는 알려지지 않았거나 잠재적으로 배양되지 않은 미생물의 정체를 관심 성장 기질을 사용하는 능력과 연결하는 데 널리 사용되는 기술이 된 DNA 동위원소 프로빙 또는 DNA sip에 대한 절차를 보여 드리겠습니다.

우리는 Newfeld 실험실에서 이 절차를 사용하여 다양한 육상 및 수생 환경에서 탄소원의 대사를 연구합니다. 오늘 우리는 토양 샘플에 특정 탄소 기질 13 C 포도당을 적용하는 방법을 보여 드리겠습니다. 그러나 우리는 이 방법이 워릭 대학(University of Warwick)의 콜린 멀(Colin Merle)의 그룹에 의해 처음 개발된 이래로 연구자들이 다양한 환경에 적용하고 질소 및 산소와 같은 다양한 표지된 동위원소를 사용하기 위해 프로토콜을 다양화했다는 것을 인정합니다.

오늘은 탄소에 초점을 맞추겠지만, 프로토콜 자체는 다양한 실험 설계에 적용할 수 있습니다. 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하기 전에 이 프로토콜의 서면 부분에 설명된 대로 모든 DNA 안정 동위원소 프로빙 또는 DNA CYP 시약을 준비합니다.

DNAC는 검체 배양으로 시작됩니다. 배양 조건은 다양한 시료 및 기질 특성에 따라 크게 달라집니다. 적절한 배양 조건이 경험적으로 결정되면 환경 샘플에 적절한 기질 수정을 추가합니다.

또한 테스트 배양을 기반으로 필요한 경우 미생물 성장을 가능하게 하는 보충 영양소를 포함하도록 선택할 수도 있습니다. 샘플 배양이 설정되면 샘플을 덮고 밀봉한 다음 라벨링된 기질이 포함된 환경 샘플을 배양합니다. 표시된 예는 토양 샘플에 탄소 13 표지된 포도당 용액을 첨가하는 것과 관련이 있습니다.

다음으로, 후속 단계에서 관찰된 핵산의 명백한 표지를 확인하기 위한 비교 역할을 하는 대조군 배양을 설정합니다. 표지되지 않은 탄소를 기질 캡으로 사용하는 것을 제외한 동일한 조건에서 이 시료를 준비하고, 원하는 다운스트림 응용 분야에 적합한 추출 프로토콜을 사용하여 소우주에서 DNA인 배양 추출물 후 동일한 조건에서 표지되지 않은 기질로 환경 시료를 밀봉하고 배양합니다. 그런 다음 aous gel과 분광 광도계를 사용하여 다음 초원심분리 단계를 위해 추출된 DNA를 정량화합니다.

초원심분리를 위해 수직 또는 근 수직 로터를 사용하여 가벼운 DNA와 무거운 DNA를 최대한 분리할 수 있습니다. 벡크만쿨터 VTI 65.2 로터에는 초원심분리를 위한 시료 준비를 위해 5.1밀리리터 퀵 씰 폴리머 튜브를 고정할 수 있는 16개의 웰이 있습니다. 먼저 초원심분리기 튜브에 0.5-5마이크로그램의 DNA를 추가하는 데 필요한 추출된 DNA의 부피를 계산합니다.

이전에 결정된 DNA 농도를 사용합니다. 그런 다음 디지털 굴절계를 사용하여 염화 세슘 원액의 정확한 밀도를 측정합니다. 서면 프로토콜에서 제안한 대로 적절한 혼합 비율을 생성하는 데 필요한 gradient buffer DNA solution의 부피를 계산합니다.

이러한 계산을 사용하여 추출된 DNA를 구배 완충액 및 4.8ml의 염화세슘과 함께 멸균 일회용 15ml 튜브에 결합합니다. 결과 부피는 튜브를 완전히 채우기 위해 원심분리기 튜브의 지정된 용량보다 커집니다. 마지막으로 이 프로토콜의 10배 변형으로 튜브를 반전시켜 솔루션을 만듭니다.

그래디언트 용액 내에서 ahy 및 bromide와 같은 식물군을 사용하여 튜브 내에서 DNA를 시각화할 수 있습니다. 여기에 표시된 바와 같이 AUM 브로마이드 구배를 포함한 순수 배양 DNA로 준비할 때 DNA의 밀도를 변경하는 것은 각 원심분리기 후 구배 형성을 즉시 시각적으로 확인하는 데 특히 유용합니다. 이러한 방법을 사용하는 실행 단계는 작성된 프로토콜에 설명되어 있습니다.

초원심분리를 먼저 설정하려면 전구를 사용하고 피펫을 통과시켜 초원심분리 튜브에 구배 용액을 조심스럽게 채웁니다. 튜브 숄더에 있는 튜브에 미세한 영구 마커로 레이블을 붙입니다. 불충분하게 채워진 튜브는 초원심분리 중에 파열되는 경향이 있으므로 튜브가 튜브 넥의 바닥까지 정확히 채워졌는지 확인하십시오.

필요한 모든 튜브가 샘플 용액으로 채워지면 각 튜브의 정확한 질량을 밀접하게 일치하는 쌍으로 분류하고 10mg 이내로 균형을 이룰 때까지 새로운 양의 용액을 추가하거나 제거합니다. 용액 수준을 튜브 바닥에 최대한 가깝게 유지하십시오. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 튜브 토퍼를 사용하여 튜브를 밀봉합니다.

튜브를 뒤집고 적당한 압력을 가하여 튜브가 제대로 밀봉되었는지 확인하십시오. 튜브의 무게를 다시 측정하여 초원심분리 전에 밀봉한 후에도 여전히 균형이 잡혀 있는지 확인합니다. 각 로터를 주의 깊게 검사하여 깨끗하고 튜브에 구멍을 뚫을 수 있는 먼지와 파편이 없는지 확인하십시오.초원심분리 중에 튜브에 구멍을 뚫을 수 있는 먼지와 파편이 없는지 확인하십시오.

튜브를 로터에 삽입하고 균형 잡힌 쌍을 서로 반대편에 놓습니다. 초원심분리 공정으로 마커 라벨을 읽을 수 있으므로 각 샘플의 로터 위치를 기록하십시오. 제조업체에서 표시한 대로 로터 웰을 조심스럽게 밀봉하십시오.

로터 웰이 밀봉되면 로터를 초원심분리기에 로드합니다. 초원심분리기 도어를 닫고 VTI 65.2 로터에 진공 청소기를 적용합니다. 회전 속도를 44, 100RPM, 온도를 섭씨 20도, 초원심분리 시간을 36-40시간으로 설정합니다.

진공이 켜져 있는지 확인하고 최대 가속을 선택하고 브레이크를 꺼서 감속으로 인해 그라디언트가 중단되지 않도록 합니다. 초원심분리 직후 로터를 조심스럽게 제거하십시오. 튜브 내부의 기울기를 방해하지 않도록 로터를 기울이거나 부딪히지 않도록 주의하십시오.

마지막으로, 구배 분별을 위해 튜브를 부드럽게 제거합니다. DNA는 분획 기법을 사용하여 초원심분리기 튜브에서 추출할 수 있습니다. 시작하려면 멸균 60ml 주사기에 충분한 프로포폴 블루 염료가 함유된 멸균 증류 및 탈이온수를 채웁니다.

짙은 파란색을 제공하려면 주사기 펌프의 로딩 암에 주사기를 놓습니다. 그런 다음 23 게이지 1인치 바늘이 장착된 펌프 튜브를 연결하고 바늘 끝을 통해 물이 나올 때까지 펌프를 켭니다. 급수 장치에 기포가 있으면 분별 과정에 부정적인 영향을 미치므로 피하십시오.

각 샘플에 대해 샘플 수와 분율을 나타내는 라벨이 있는 12개의 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브를 준비합니다. 다음으로, 초원심분리 튜브 중 하나를 빠르고 제어된 동작으로 클램프 스탠드에 고정합니다. 새로운 23 게이지 1인치 바늘을 사용하여 튜브 이음새를 따라 튜브 바닥을 뚫고 바늘을 회전하여 균일한 구멍이 형성되었는지 확인합니다.

라텍스 장갑이 니트릴 장갑보다 바늘 샤프트를 더 잘 잡을 수 있음을 알 수 있습니다. 펌프 튜브에 부착된 바늘을 사용하여 솔기를 따라 상부 튜브 어깨에 있는 튜브 상단을 빠르고 제어된 방식으로 뚫습니다. 튜브의 상단을 뚫은 다음 튜브의 바닥을 뚫는 것도 할 수 있습니다.

또한 튜브의 숄더를 코팅하는 소량의 미네랄 오일은 이전에 보정된 펌프 속도로 상부 바늘 주위의 부적절한 밀봉으로 인한 누출을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 염색된 물을 튜브 상단으로 펌핑하여 12분 안에 12,425마이크로리터 분획을 생성합니다. 타이머를 사용하여 라벨이 부착된 마이크로 원심분리기 튜브에서 그래디언트 용액을 수집합니다.

마지막으로, 하나 이상의 표본 또는 제어 구배에 대한 모든 분획의 밀도를 확인합니다. 디지털 굴절계를 사용합니다. 밀리리터당 1.690에서 1.760g 사이의 값을 예상하고 중간 밀도는 밀리리터당 약 1.725g으로 모든 분획에서 DNA를 침전시킵니다.

먼저, 20마이크로그램의 선형 폴리 아크릴아미드를 침전을 위한 운반체로 추가하고 반전으로 혼합합니다. 그런 다음 두 부피의 PEG 용액을 추가하고 다시 반전으로 혼합합니다. 배양 후 DNA가 침전될 수 있도록 튜브를 실온에 2시간 동안 그대로 둡니다.

펠릿 원심분리기의 일관된 위치 파악을 보장하기 위해 튜브가 같은 방향을 향하도록 샘플을 마이크로 원심분리기에 넣었습니다. 13, 000 G에 관은 분리기 후에 30 분 동안 마이크로 분리기에서 표본을 만회하고, 그 후에 주의깊게 흡인하고 supernat app를 버린다. 펠릿은 이 단계에서 밝은 광원의 도움으로 볼 수 있어야 합니다.

펠릿 원심 분리기를 세척 한 후 500 마이크로 리터의 70 % 에탄올로 펠릿을 세척하십시오. 13, 000 G에 표본은 분리기 후에 10 분 동안 주의깊게 흡입하고 supernat를 버린다. 펠릿은 이제 더 잘 보이지만 튜브 벽에서 더 쉽게 분리됩니다.

펠릿을 실온에서 15분 동안 건조시킵니다. 펠릿이 건조되면 각 펠릿을 50마이크로리터의 TE 버퍼에 현탁시킵니다. 마지막으로, 에어로스 겔에서 각 분획을 5마이크로리터씩 실행하여 서면 프로토콜에서 논의된 방법을 사용하여 구배 분획을 특성화합니다.

일반적인 DNA SIP 결과는 초원심분리에 의한 그래디언트 형태의 표지된 DNA와 표지되지 않은 DNA의 분리를 보여줍니다. 이상적으로는 탄소 13 및 질소 15와 같은 고분자량 유전 물질, 특히 라벨링되지 않은 물질, 안정 동위원소 배양 샘플의 분획 4에서 8과 관련된 고유한 PCR 기반 지문의 완전한 해상도가 있어야 하지만 네이티브 기질은 그렇지 않습니다. 배양된 대조군은 두 개의 순수 배양물, 즉 탄소 13 표지된 메틸 occus capsulitis 균주 수조와 표지되지 않은 게놈 DNA로 표지된 Sian medi A TCC 10 21의 DNA에 대해 수행할 때 특정 유기체를 특정 표지된 기질의 대사와 연결하는 강력한 증거를 제공합니다.

이 예에서 무거운 동위원소 표지된 DNA는 분획 4에서 5까지 관찰될 수 있는 반면, 표지되지 않은 DNA는 분획 9에서 10까지 고농도로 발견됩니다. 동일한 분획에서 증폭된 PCR은 변성 및 구배 젤 전기영동 또는 DGGE를 사용하여 실행되었으며 구배에 포함된 두 유기체에 해당하는 개별 밴딩 패턴을 생성했습니다. 분획의 밀도 범위는 밀리리터당 약 1.580에서 1.759g 사이이며 왼쪽에서 오른쪽으로 밀도가 감소하는 순서로 표시됩니다.

반대로, 동위원소와 환경 시료 배양의 분리는 해석하기가 더 어려울 수 있습니다. 캐나다 레졸루트 베이(Resolute Bay)의 툰드라 토양을 탄소 12 또는 탄소 13 표지 포도당으로 섭씨 15도에서 14일 동안 배양했습니다. 정제된 구배 분획 DNA의 에어로스 겔은 탄소 12와 탄소 13 배양 모두에 대해 분획 7에서 10에 걸쳐 게놈 DNA를 도말로 표시했습니다.

그러나 16 s 리보솜 RNA 유전자의 DGGE를 사용하여 특정 미생물 분류군에서 바이오매스의 탄소 13 농축을 결정했을 때, 탄소 12 포도당을 배양한 토양, DNA는 모든 구배 분획에서 유사한 패턴을 생성했으며 탄소 13 포도당을 배양한 샘플은 분획 5에서 8과 고유하게 관련된 DGG 지문을 생성했습니다. 화살표로 표시된 보존된 띠는 모든 구배 분율에 걸쳐 일관된 우세한 phylo 유형을 나타냅니다. phylo 유형은 탄소 13 포도당을 배양한 토양에서 얻은 DNA에 대해 더 무거운 분획으로 이동합니다. 이 특정 16 s 리보솜 RNA 유전자의 정체는 후속 메타유전체학(metagenomic) 또는 배양 기반 접근법을 안내하기 위해 결정될 수 있습니다.

샘플 배양부터 분자 분석을 위해 라벨링된 DNA를 얻는 것까지 DNA 안정 동위원소 프로빙 실험을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 실험 설계를 신중하게 고려하고 빠르게 성장하는 유기체에 대한 실험 편향을 피하기 위해 너무 많은 기질을 추가하지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 또한 기질이 먹이 그물을 통해 커뮤니티의 다른 구성원에게 희석되지 않도록 확장된 배양을 피하고 싶습니다.

따라서 적절한 양의 기질과 충분한 배양 시간을 사용하여 민감한 PCR 기반 응용 분야에서 무거운 분획에서 소량의 표지된 DNA를 검출할 수 있어야 합니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.