염색질 전단(Chromatin Shearing): 효소 분해를 사용하여 염색질 단편을 생성하는 방법

- 전사 인자(transcription factor)는 유전자 발현을 조절하기 위해 DNA의 특정 부위에 결합하는 단백질입니다. 전사 인자(transcription factor)의 오류는 이러한 활동을 변화시켜 유전자의 과잉 발현으로 이어져 암을 유발합니다. 전사 인자와 유전자 조절의 역할을 이해하기 위해 염색질 면역침전 분석 또는 CHIP를 수행할 수 있으며, 염색질 전단은 CHIP 워크플로우에서 중요한 단계입니다.

염색질 전단을 위해 포름알데히드를 첨가하여 DNA-단백질 복합체를 안정화합니다. 포름알데히드는 공유 결합을 형성하여 단백질을 관련 DNA 염기서열에 가교결합합니다. 다음으로, 적절한 용해 완충액을 사용하여 세포를 용해하여 가교 결합된 DNA-단백질 복합체와 원심분리기를 포함하는 염색질을 방출합니다. 마이크로코커스 뉴클레아제 효소를 사용하여 염색질을 전단합니다. 이 효소는 뉴클레오솜 사이의 염색질을 절단하고 느슨한 DNA 말단을 소화합니다. 혼합물을 원심분리하고 상층액을 수집합니다.

TBE 아가로스 겔에 상층액을 로드하여 적절한 크기의 DNA 단편을 분석합니다. 겔 전체에 전기장을 가하면 음전하를 띤 염색질 DNA가 양극 쪽으로 이동합니다. 더 작은 조각은 겔 아래로 더 이동합니다. 전단된 염색질은 겔에서 번짐으로 나타납니다. 다음 프로토콜에서는 초음파 처리를 사용하여 만성 골수성 백혈병 세포주의 염색질을 전단합니다.

- 시작하려면 1.5mm 튜브에 1ml의 37% 포름알데히드를 채웁니다. 그런 다음 다른 1.5ml 튜브에 1.25몰 글리신 1ml를 채우고 5ml 튜브에 PBS 4ml를 채웁니다. 다음으로, 세포를 자극한 후 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 회전시키고 세포를 500마이크로리터의 PBS에 다시 현탁시키고 튜브를 얼음으로 채워진 상자에 넣습니다. 13.5% 마이크로리터의 37% 포름알데히드를 세포에 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.

그런 다음 실온에서 현탁액을 배양합니다. 그런 다음 57 마이크로 리터의 1.25 몰 글리신을 첨가하여 고정을 중단하고이 현탁액을 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 배양 직후 세포를 얼음 위에 놓고 섭씨 4도에서 5분 동안 500배 g으로 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 흡입합니다. 다음으로, 1ml의 얼음처럼 차가운 PBS를 200회 g씩 4°C에서 5분간 2회 세척한 후 상층액을 제거한다. 세포 펠릿을 5ml의 lysis buffer-1에 위아래로 피펫팅하여 재현탁합니다.

그런 다음 샘플을 얼음 위에 놓고 10분 동안 흔들면서 배양합니다. 그 후, 섭씨 4도에서 5분 동안 500회 g으로 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 5 ml의 lysis buffer-2와 피펫을 위아래로 넣어 세포를 균질화하여 혼합합니다. 그런 다음 얼음 위에서 10분 동안 흔들면서 세포를 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 섭씨 4도에서 500 회 g의 튜브를 5 분 동안 원심 분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

다음으로, 세포 펠릿을 1X 프로테아제 억제제로 shearing buffer-1에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 세포 현탁액을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 140 마이크로 리터의 세포 현탁액을 초음파 처리기 튜브로 옮기고 기포가 형성되지 않도록주의하십시오. 튜브를 섭씨 7도의 집속 초음파기에 넣고 10분에서 7분 30초 동안 전단합니다. 세포 현탁액을 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 15,700배의 g으로 샘플을 원심분리하고 새 튜브에 상층액을 수집합니다.