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암 연구
0 조회수 • 6:29 분 • April 30th, 2023
- 염색질 면역침전(ChIP)은 세포에서 단백질-DNA 상호작용을 결정하는 데 사용되는 기술입니다. 단백질은 DNA의 특정 부위에 결합하여 유전자 발현을 조절합니다. 먼저 포름알데히드로 DNA-단백질 복합체를 안정화합니다. 포름알데히드는 공유 결합을 형성하여 단백질을 관련 DNA 염기서열에 가교결합합니다.
다음으로, 적절한 용해 완충액을 사용하여 세포를 용해하여 가교된 DNA-단백질 복합체를 포함하는 염색질을 방출합니다. 현탁액을 원심분리하고 상등액을 초음파 처리하여 염색질 단편을 얻습니다. 그런 다음 DNA 결합 단백질에 특이적으로 결합하는 적절한 항체로 샘플을 라벨링합니다.
샘플에 특수 마그네틱 비드를 추가합니다. 비드는 항체를 인식하고 결합합니다. 자석을 사용하여 항체-단백질-DNA 복합체가 있는 마그네틱 비드를 수집합니다. 샘플을 세척하여 결합되지 않은 염색질 또는 항체를 제거합니다. 복합체에 고염 농도 완충액을 추가하고 더 높은 온도에서 배양하여 DNA 단백질 가교를 역전시킵니다.
자석을 사용하여 DNA와 단백질을 포함하는 상층액을 수집합니다. proteinase K 효소를 첨가하여 샘플의 단백질을 분해합니다. DNA를 침전시키기 위해 적절한 완충액을 추가하고 추가 분석에 사용합니다. 다음 프로토콜은 NFAT2 표적 유전자를 확인하기 위해 만성 림프구성 백혈병 세포에서 염색질 면역침전을 입증합니다.
- 먼저, 하나의 1.5 밀리리터 튜브에 각 침전에 대해 20 마이크로 리터의 단백질 A 코팅 비드를 준비합니다. 비드가 마그네틱 랙에 1분 동안 가라앉도록 하고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 위아래로 피펫팅하여 단백질 A 코팅 비드 20마이크로리터당 1x ChIP 버퍼 1 40마이크로리터로 비드를 세척합니다.
비드가 마그네틱 랙에 1분 동안 가라앉도록 하고 상층액을 제거합니다. 이 세척 과정을 세 번 더 반복한 후 비드를 원래 부피인 1x ChIP 버퍼 1로 다시 현탁시킵니다. BSA, 프로테아제 억제제, 5x ChIP 완충액 및 ChIP-seq 등급의 물을 비드에 추가합니다. 다음으로 전단된 염색질을 추가합니다.
NFAT2를 캡처하려면 10마이크로그램의 항-NFAT2 항체를 사용하고 대조군으로 2.5마이크로그램의 IgG 항체를 사용합니다. 6RPM으로 회전하는 휠에서 섭씨 4도에서 밤새 혼합물을 배양합니다. 다음 날, 7,000g에서 5초 동안 튜브를 돌리고 마그네틱 랙에서 1분 동안 배양합니다.
그런 다음 상층액을 흡인하고 세척 완충액 1, 2, 3, 4로 비드를 한 번 연속적으로 세척합니다. 7,000g에서 5초 동안 튜브를 돌린 후 마그네틱 랙에서 1분 동안 튜브를 배양합니다. 그런 다음 상등액을 제거하고 다음 세척 버퍼를 추가합니다.
마지막 세척 후 튜브를 7,000회 g으로 5초 동안 돌립니다. 마그네틱 랙에서 튜브를 1분 동안 배양합니다. 상층액을 제거하고 100 마이크로 리터의 용리 완충액 1에 비드를 흡수합니다. 그런 다음 회전하는 바퀴의 튜브를 30분 동안 배양합니다.
다음으로, 튜브를 간단히 돌리고 1분 동안 마그네틱 랙에 놓습니다. 상등액을 새 1.5ml 튜브로 옮기고 4마이크로리터의 용리 완충액 2를 추가합니다. 입력 컨트롤을 만들려면 1마이크로리터의 전단 염색질을 99마이크로리터의 용리 버퍼 1 및 4마이크로리터의 용리 버퍼 2와 혼합합니다. 그런 다음 섭씨 65도에서 4시간 동안 흔들면서 샘플을 배양합니다.
그런 다음 튜브에 100 % 이소프로판올 100 마이크로 리터를 첨가하십시오. 샘플을 소용돌이치고 7,000회 g으로 5초 동안 회전시킵니다. 그런 다음 각 샘플에 10마이크로리터의 마그네틱 비드를 추가합니다. 한 시간 동안 실온에서 회전하는 휠에서 샘플을 소용돌이치고 배양합니다.
그런 다음 튜브를 짧게 돌리고 1분 동안 마그네틱 랙에 놓습니다. 상층액을 흡인하고 비드를 100마이크로리터의 세척 완충액 1에 재현탁합니다. 튜브를 뒤집어 섞고 실온에서 회전하는 바퀴에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로 튜브를 간단히 원심분리합니다. 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.
그런 다음 100마이크로리터의 세척 버퍼 2를 추가합니다. 튜브를 뒤집어 섞고 실온에서 회전하는 바퀴에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 잠시 원심분리하고 1분 동안 마그네틱 랙에 넣습니다. 흡인을 통해 세척 완충액 2개를 제거하고 비드를 55마이크로리터의 용리 완충액에 재현탁합니다.
침전된 DNA를 용리시키려면 실온에서 15분 동안 회전하는 휠에서 샘플을 배양합니다. 그런 다음 튜브를 짧게 돌리고 1분 동안 마그네틱 랙에 넣습니다. 마지막으로 상등액을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다.