0 조회수 • 5:21 분 • April 30th, 2023
- 조혈줄기세포와 전구세포(HSPC)는 자가 재생이 가능하여 다양한 형태의 혈액 세포로 분화할 수 있습니다. HSPC는 일생 동안 DNA 돌연변이를 점진적으로 축적하여 백혈병에 기여할 수 있습니다. 이러한 돌연변이를 분석하기 위해 HSPC는 일반적으로 골수에서 생성됩니다.
먼저 단핵 세포(골수에서 분리된 성체 줄기 세포)에 형광단 접합 항체를 추가하고 원하는 기간 동안 배양합니다. 항체는 CD34와 같은 특정 세포 표면 마커에 결합합니다. 이제 형광 활성화 세포 분석 또는 FACS 기계에 혼합물을 로드합니다.
형광단 접합 항체는 레이저에 부딪히면 형광을 발합니다. 개별 세포 방울은 형광 강도를 측정하는 검출기를 통과하며, 이를 기반으로 방울은 전하를 가지고 있습니다. 전자기장이 존재하면 양전하를 띤 세포가 음극 용기로 이동하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
이제 클론이 보일 때까지 원하는 기간 동안 적절한 배지에서 FACS로 분류된 CD34 양성 HSPC를 성장시킵니다. 다음으로, 세포를 펠릿화하기 위해 격렬한 피펫팅과 원심분리로 클론을 제거합니다. 추가 분석을 위해 클론 HSPC가 포함된 펠릿을 섭씨 영하 20도에 보관하십시오. 다음 프로토콜에서는 단핵 세포에서 HSPC 클론을 생성합니다.
- 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플 재료 준비 및 염색으로 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 25ml의 조혈 줄기 및 전구 세포 또는 HSPC, 배양 배지를 준비합니다. 384웰 세포 배양 플레이트에 각 웰에 75마이크로리터의 HSPC 배양 배지를 채웁니다. 외부 웰에서 매체의 증발을 방지하려면 외부 웰에 75마이크로리터의 멸균수 또는 PBS를 채우고 이러한 웰을 세포 분류에 사용하지 마십시오.
실행 가능한 신호 HSPC의 올바른 정렬은 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. 염색 샘플의 10,000개 세포에서 염색되지 않은 대조군을 기반으로 HSPC 분류를 위한 게이트를 설정합니다. 선형 전방 산란 높이 대 전방 산란 영역 비율 주위에 게이트를 그려 단일 셀을 게이트합니다.
염색되지 않은 대조군 분획을 사용하여 계통 분획에 대한 게이트를 그립니다. CD34 양성 세포에 대한 게이트를 그리고, CD38 음성, CD45RA 음성 세포에 대한 특정 게이트를 설정하여 이 하위 집합을 추가로 특성화합니다. FACS 기계에 384웰 플레이트를 로드하고 단일 셀을 분류합니다. FACS 시스템에 적용 가능한 경우 정렬된 셀을 다시 추적할 수 있도록 인덱스 정렬 데이터를 유지하는 옵션을 켭니다.
단독으로 분류된 HSC를 배양하려면 뚜껑이 있는 384웰 배양 플레이트를 투명 폴리에틸렌 랩으로 감쌉니다. 384웰 플레이트를 이산화탄소가 5%인 가습된 섭씨 37도 인큐베이터로 옮기고 눈에 보이는 클론이 나타날 때까지 3-4주 동안 인큐베이터에 보관합니다. 4주간의 배양 후 어떤 웰의 합류도가 30% 이상인지 확인합니다.
각 클론에 대해 PBS에 1.5mm 마이크로튜브에 1mL의 1% BSA를 미리 채우고 해당 웰에 따라 튜브에 라벨을 붙입니다. PBS에서 1% BSA로 피펫 팁을 미리 적셔 피펫 팁에 달라붙는 세포의 수를 최소화합니다. 75마이크로리터로 설정된 200마이크로리터 피펫으로 우물 바닥을 긁어내면서 배지를 위아래로 5회 격렬하게 피펫팅합니다.
웰에 해당하는 라벨링된 마이크로튜브에서 세포 현탁액을 수집합니다. 최대 75마이크로리터의 신선한 1% BSA 및 PBS를 사용하여 웰에서 피펫팅을 반복하여 세포를 최대한 흡수할 수 있습니다. 클론 배양된 세포는 웰 바닥에 달라붙을 수 있습니다. 표준 도립 광 현미경을 사용하여 웰을 검사하여 모든 세포가 수집되었는지 확인합니다.
포화도가 30% 이상인 모든 웰을 수확한 경우 384웰 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 클론 배양은 최대 5주 동안 증식할 수 있습니다. 350 회 g에서 5 분 동안 세포 현탁액을 스핀 다운합니다. 작은 펠릿이 보여야 합니다. 약 5마이크로리터의 상층액을 제외한 모든 것을 조심스럽게 제거합니다. 세포 펠릿은 영하 20도에서 동결할 수 있으며 DNA를 분리하기 전에 수개월 동안 보관할 수 있습니다.