HSPC 클론의 배양 및 수확: 단일하게 분류된 HSPC 클론을 얻는 방법

- 조혈줄기세포와 전구세포(HSPC)는 자가 재생이 가능하여 다양한 형태의 혈액 세포로 분화할 수 있습니다. HSPC는 일생 동안 DNA 돌연변이를 점진적으로 축적하여 백혈병에 기여할 수 있습니다. 이러한 돌연변이를 분석하기 위해 HSPC는 일반적으로 골수에서 생성됩니다.

먼저 단핵 세포(골수에서 분리된 성체 줄기 세포)에 형광단 접합 항체를 추가하고 원하는 기간 동안 배양합니다. 항체는 CD34와 같은 특정 세포 표면 마커에 결합합니다. 이제 형광 활성화 세포 분석 또는 FACS 기계에 혼합물을 로드합니다.

형광단 접합 항체는 레이저에 부딪히면 형광을 발합니다. 개별 세포 방울은 형광 강도를 측정하는 검출기를 통과하며, 이를 기반으로 방울은 전하를 가지고 있습니다. 전자기장이 존재하면 양전하를 띤 세포가 음극 용기로 이동하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.

이제 클론이 보일 때까지 원하는 기간 동안 적절한 배지에서 FACS로 분류된 CD34 양성 HSPC를 성장시킵니다. 다음으로, 세포를 펠릿화하기 위해 격렬한 피펫팅과 원심분리로 클론을 제거합니다. 추가 분석을 위해 클론 HSPC가 포함된 펠릿을 섭씨 영하 20도에 보관하십시오. 다음 프로토콜에서는 단핵 세포에서 HSPC 클론을 생성합니다.

- 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플 재료 준비 및 염색으로 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 25ml의 조혈 줄기 및 전구 세포 또는 HSPC, 배양 배지를 준비합니다. 384웰 세포 배양 플레이트에 각 웰에 75마이크로리터의 HSPC 배양 배지를 채웁니다. 외부 웰에서 매체의 증발을 방지하려면 외부 웰에 75마이크로리터의 멸균수 또는 PBS를 채우고 이러한 웰을 세포 분류에 사용하지 마십시오.

실행 가능한 신호 HSPC의 올바른 정렬은 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. 염색 샘플의 10,000개 세포에서 염색되지 않은 대조군을 기반으로 HSPC 분류를 위한 게이트를 설정합니다. 선형 전방 산란 높이 대 전방 산란 영역 비율 주위에 게이트를 그려 단일 셀을 게이트합니다.

염색되지 않은 대조군 분획을 사용하여 계통 분획에 대한 게이트를 그립니다. CD34 양성 세포에 대한 게이트를 그리고, CD38 음성, CD45RA 음성 세포에 대한 특정 게이트를 설정하여 이 하위 집합을 추가로 특성화합니다. FACS 기계에 384웰 플레이트를 로드하고 단일 셀을 분류합니다. FACS 시스템에 적용 가능한 경우 정렬된 셀을