Magnetic-Activated Cell Sorting: c-kit 양성 세포를 분리하는 방법

- c-Kit 또는 CD117은 골수와 혈액에 존재하는 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포에 의해 발현되는 티로신 키나아제 막관통 수용체입니다. 또한 급성 골수성 백혈병을 감지하기 위한 마커이기도 합니다.

c-Kit 양성 세포를 분리하려면 쥐 다리 뼈를 채취하여 부숴서 내부에서 골수를 방출합니다. 골수 현탁액을 여과하여 뼈 조각을 제거합니다. 골수 세포를 포함하는 여과액을 밀도 구배 배지에 적층하고 원심분리하여 다른 분획에서 단핵 세포를 분리합니다.

항-CD117 마우스 항체에 접합된 마이크로비드가 들어 있는 튜브에서 단핵 세포의 탁한 층을 수집합니다. 항체-비드 복합체가 c-Kit 양성 세포의 CD117 수용체에 결합할 수 있도록 배양합니다. 배양된 현탁액을 자기장에 배치된 자기 기둥을 통과시킵니다. 마그네틱 마이크로비드로 라벨링된 모든 c-Kit 양성 세포는 컬럼에 남아 있는 반면, 라벨링되지 않은 세포는 통과합니다.

자기장에서 컬럼을 제거하고 적절한 버퍼를 사용하여 내용물을 세척하여 c-Kit 양성 세포를 용리시킵니다. 다음 프로토콜에서는 형질전환 마우스의 골수에서 c-Kit 양성 세포의 분리를 보여줍니다.

- 먼저 안락사된 쥐의 다리 뼈를 채취합니다. 메스로 뼈의 조직을 청소하십시오. 그런 다음 얼음 위의 차가운 PBS에 뼈를 넣고 유봉으로 뼈를 으깨십시오. 그런 다음 70마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 10ml 피펫을 사용하여 50ml 스크류 캡 튜브에 셀 현탁액을 여과합니다. 차가운 PBS로 모르타르와 유봉을 여러 번 세척하고 50ml 튜브에 세포 현탁액을 추가합니다.

다음으로 골수를 원심분리하고 진공과 유리 피펫으로 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 PBS 5ml에 재현탁합니다. 피펫을 사용하여 현탁된 골수를 실온의 다수당(polysucrose) 상단에 천천히 추가합니다.

그런 다음 브레이크를 끈 상태에서 400G에서 20분 동안 폴리수크로오스를 회전시킵니다. 분리(cetrifugation) 후, 피펫으로 흐린 전체 단핵 전지 계면을 수집하여 새로운 15ml 튜브로 옮깁니다. PBS로 부피를 10밀리리터로 가져오고 계산을 위해 20마이크로리터를 제거합니다.

분리 후 상층액을 버리고 펠릿을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, EDTA 및 BSA로 PBS에서 세포 펠릿을 재현탁합니다. CD117 마이크로비즈를 세포 현탁액과 와류에 첨가하여 혼합합니다. 그 후, 섭씨 4도에서 10 분 동안 현탁액을 배양하십시